褐黄孢链霉菌重组表达质粒及工程菌与应用

褐黄孢链霉菌重组表达质粒及工程菌与应用
【专利摘要】本发明涉及褐黄孢链霉菌重组表达质粒及工程菌与应用，通过克隆褐黄孢链霉菌纳他霉素生物合成基因簇中的具有正调控作用的两个基因(pimM和pimE)及外源血红蛋白基因vgb，成功构建了表达载体pIMEP::pimE：:pimM：:vgb；通过带有表达载体pIMEP::pimE：:pimM：:vgb的大肠杆菌ETZ与褐黄孢链霉菌的结合转移实验获得了褐黄孢链霉菌工程菌株；褐黄孢链霉菌工程菌株因纳他霉素生物合成基因簇中的调控基因pimM和胆固醇氧化酶基因pimE过表达的叠加效应，及血红蛋白基因vgb的耐贫氧性能，可提高纳他霉素生物合成基因簇的转录，从而显著提高纳他霉素的产量。CGMCC No.1179020151204
【专利说明】
褐黄孢链霉菌重组表达质粒及工程菌与应用
技术领域
[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，尤其是褐黄孢链霉菌重组表达质粒及工程菌与应 用。
【背景技术】
[0002] 纳他霉素是一种多烯大环内酯类广谱抗真菌剂。它能有效地抑制和杀死霉菌、酵 母菌、丝状真菌，因此可以有效地降低强致病性真菌素对人类的侵害。与其他抗菌成分相比 纳他霉素对哺乳动物细胞的毒性极低，可以广泛应用于真菌引起的疾病。由于纳他霉素无 毒、不致畸、对人体无害无残留等特性，1982年，美国FDA正式批准纳他霉素的食品防腐剂用 途。我国卫生部于1997年也正式批准纳他霉素的食品防腐剂资质。如今，纳他霉素已经广泛 被应用于食品行业，此外，纳他霉素也被广泛用于医疗、饲料、粮储等领域中。
[0003] 目前，在链霉菌属（Streptomyces)、短杆菌属（Brevibacterium)、假单胞菌属 (Pseudomonas)、红球菌属(Schizopylium)等细菌中均发现有胆固醇氧化酶。在纳他霉素生 物合成基因簇中，pimE编码胆固醇氧化酶。目前已从链霉菌属中分离出胆固醇氧化酶基因， 其编码的胆固醇氧化酶属于乙酰胆固醇氧化酶家族的成员，可催化胆固醇形成17-酮类固 醇和过氧化氢。2007年Marta等人通过基因敲除与互补实验发现，在纳塔尔链霉菌中，pimE 编码一种功能性胆固醇氧化酶，并且该酶对纳他霉素的生物合成有关。纳他霉素的生物合 成过程并不需要胆固醇的参与，但是通过向敲除PimE的工程菌株中，添加纯化后的PimE蛋 白或异源的固醇氧化酶时，均可显著提高纳他霉素的产量。故Marta等人推测胆固醇氧化酶 是纳他霉素生物合成中的一种分泌到胞外的信号蛋白，对纳他霉素的生物合成起着正调控 作用。浙江大学孙志豪论文中指出，胆固醇氧化酶基因在恰塔努加链霉菌中也有着相似的 作用，并推测胆固醇氧化酶基因与两个调控基因 pimR和pimM对纳他霉素生物合成可能存在 协同调控作用。
[0004] 纳他霉素生物合成基因簇的调控基因为pimR和pimM，分别编码两个转录因子。在 纳塔尔链霉菌（Streptomyces natalensis)中，PimM基因是纳他霉素生物合成基因簇中正 转录调控因子。PimM作为PAS调控蛋白，能够激活基因簇中部分基因的转录。在纳塔尔链霉 菌中，pimM敲除菌株丧失了纳他霉素的合成能力，增加 pimM基因的拷贝能够提高纳他霉素 产量。浙江大学孙志豪论文指出，在恰塔努加链霉菌（Streptomyces chattanoogensis)中， 与纳他霉素生物合成基因簇的调控基因 PimM功能类似的调控基因 ScnRII同样为正调控基 因，且该基因很可能同样结合在纳他霉素生物合成基因簇中的八个基因的启动子区域。在 工业生产上，通过直接增加途径特异性调控基因的拷贝数来提高抗生素产量的方法在构建 高产链霉菌株广泛应用。
[0005] 褐黄孢链霉菌为好氧菌，随着发酵时间延长，菌体密度迅速增加。发酵过程中，溶 氧不足可使菌体生长缓慢，纳他霉素合成关键酶表达量降低，进而使纳他霉素产量降低。研 究发现，VHb在贫氧条件下的表达，能显著促进大肠杆菌及酿酒酵母细胞的生长，提高蛋白 质合成能力，增加目的产物的产量。此外，vgb基因也被应用到芽孢杆菌、欧文氏菌、产黄头 孢霉等微生物中，成功提高了淀粉酶、维生素 C，头孢菌素 C等生化产品的产量。也有报道将 该基因导入植物中表达亦获得成功。故本发明将该基因同样导入到褐黄孢链霉菌中，通过 该基因的表达使得工程菌株获得耐贫氧能力，进而提高纳他霉素的产量。
[0006] 此外，据何艳玲报道"间歇补料分批发酵提高纳他霉素产量"，通过使初始葡萄糖 浓度40g/L，间歇补糖使葡萄糖浓度维持在2%，可使纳他霉素产量从1.5g/L提高到2.3g/L。 浙江大学梁景乐报道"纳他霉素高产菌株空间育种、工艺优化及工业放大研究"，通过比较 不同的控制条件，30L发酵规模上的最优控制条件为:发酵过程的中pH值为5.8-6.2，全程搅 拌转速为400rpm，通气量为1. Ovvm，温度为28°C。褐黄孢链霉菌为好氧菌，故在其发酵过程 中可以通过提供转速提高溶氧满足菌体对溶氧的要求。在发酵过程中，如何控制发酵条件 同样对提高纳他霉素的产量有着重要意义。

【发明内容】

[0007] 本发明所要解决的技术问题在于提供一种褐黄孢链霉菌重组表达质粒。
[0008] 本发明所要解决的另一技术问题在于提供含有上述褐黄孢链霉菌重组表达质粒 的工程菌。
[0009] 本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述工程菌的应用。
[001 0]为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
[0011] 一种褐黄孢链霉菌重组表达质粒，是由调控基因 pimM、胆固醇氧化酶基因 pimE和 外源血红蛋白基因 vgb分别插入含有红霉素启动子的载体ρΜΕΡ中得到的的重组表达载体 pIMEP: :pimE: :pimM: :vgb，重组表达载体pIMEP: :pimE: :vgb的序列为序列表〈400> 17所示序列;所述重组表达质粒为三个基因的串联表达，每个基因前均有红霉素启动子，所 述pimM的核苷酸序列为序列表〈400>1所示序列，pimE的核苷酸序列为序列表〈400>2所示序 列，vgb的核苷酸序列为序列表〈400>3所示序列，pimE/pimM/vgb及启动子的序列为序列表〈 400>16所示序列；其中，所述调控基因 pimM和出发载体ρΙΜΕΡ用BamH I/EcoR I进行酶切， pimE和出发载体ρΠΙΕΡ用BamH I进行酶切，vgb和出发载体ρΠΙΕΡ用Κρη I进行酶切;含有红 霉素启动子和调控基因（Perm: :pimM)的片段和出发载体pHffiP: :pimE用EcoR I进行酶切， 含有红霉素启动子和血红蛋白基因（Perm: :vgb)的片段和出发载体pIMEP: :pimE: :pimM用 Mun I/Spe I进行酶切。
[0012] 优选的，上述褐黄孢链霉菌重组表达质粒，所述调控基因 pimM、胆固醇氧化酶基因 pimE和外源血红蛋白基因 vgb的启动子均为红霉素启动子ermE*(Perm)。
[0013] 一种含有上述褐黄孢链霉菌重组表达质粒的工程菌（Streptomyces gilvosporeus/pIMEP: :pimE: :pimM: : vgb)，保藏号为CGMCC No. 11790。
[0014] 上述工程菌的基因组中整合有重组表达载体pMEP: :pimE: :vgb，具有高产 纳他霉素的能力，发酵120h的产量达到10.136克。
[0015] 上述工程菌的构建方法，具体步骤如下：
[0016] 将上述褐黄孢链霉菌重组表达质粒先化转入大肠杆菌ETZ中，利用褐黄孢链霉菌-大肠杆菌结合转移实验，将褐黄孢链霉菌孢子悬浮液和含有重组表达载体pMEP: :pimE:: pimM: :vgb的重组大肠杆菌ETZ菌液混合涂布到MS(含5mM MgCl2)平板，于28°C培养箱培养 16-20h，之后涂布lml无菌水(含萘啶酮酸0.4mg和阿普霉素1.5mg)进行筛选;于28°C继续培 养即可获得含有重组表达载体pMEP: :pimE: :vgb的褐黄孢链霉菌工程菌株。
[0017] 上述褐黄孢链霉菌重组表达质粒为含有纳他霉素生物合成基因簇的调控基因 pimM和胆固醇氧化酶基因 pimE及外源基因 vgb的重组表达载体pIMEP: :pimE: :vgb。
[0018] 优选的，上述工程菌的构建方法，利用褐黄孢链霉菌工程菌株含有阿普霉素抗性， 在含有阿普霉素抗性的SS平板上筛选转化子，平板中阿普霉素终浓度为15μg/ml;将平板验 证正确的转化子提取基因组，用PCR方法验证重组表达载体pIMEP: :pimE: :vgb是否 成功插入到褐黄孢链霉菌基因组中。
[0019] 上述工程菌高产纳他霉素的应用。
[0020] 优选的，上述工程菌的应用，所述工程菌的发酵条件为：制备新鲜孢子悬液，按 2 % -5 %的接种量接种于种子培养基，28 °C、200rpm培养2d，种子培养基按5 %的接种量转接 到到发酵培养基中28 °C、200rpm发酵培养。
[0021]优选的，上述工程菌的应用，所述种子培养基按g/L计为：葡萄糖20,蛋白胨6， yeast extract 6，NaCl 10，ρΗ=7·0，12?·?灭菌20min〇
[0022] 优选的，上述工程菌的应用，所述发酵培养基按g/L计为：葡萄糖40,大豆蛋白胨 15，yeast extract 5，beef extract powder 5，pH=7.5,121°C灭菌20min，其中葡萄糖配 制浓度为50 %，115 °C灭菌30min，发酵培养条件:发酵培养基中28 °C、200rpm发酵培养。
[0023] 优选的，上述工程菌的应用，包括补充碳源，调控通气量和搅拌转速，发酵过程中 30h-108h以2.5g/L-3g/L的流速流加50 %葡萄糖溶液;控制发酵液pH为6;初始通气量为4L/ min，7h升至6L/min;在相应的不同时间点调节转速，至58h调至650rpm后不再变化。
[0024]本发明的有益效果是：
[0025]本发明利用基因工程技术克隆了来自于褐黄孢链霉菌本身的调控基因 pimE和 pimM及外源血红蛋白Vgb基因，并使其成功表达，获得了纳他霉素产量较褐黄孢链霉菌出发 菌株高的褐黄孢链霉菌工程菌株S.gilvosporeus/pIMEP: :pimE: :vgb。该褐黄孢链 霉菌工程菌株应用于纳他霉素生产中，在消耗相同底物情况下褐黄孢链霉菌工程菌株能生 产更多的纳他霉素，降低生产成本，进而提高企业生产效益。
【附图说明】
[0026] 图1为本发明重组表达载体pBffiP: :pimE: :vgb的构建质粒图谱。
[0027] 图2为本发明将重组表达载体pIMEP: :pimE: :vgb转入褐黄孢链霉菌 (Streptomyces gilvosporeus)的得到的转化子。
[0028] 图3为本发明重组表达载体pIMEP: :pimE: : vgb转化褐黄孢链霉菌 (Streptomyces gilvosporeus)后获得重组菌株的PCR验证电泳图：随机挑取的3个转化子 全部能扩增出大小为3230bp的特异条带，结果表明均为阳性转化子，其中，其中，1指阴性对 照，未加模板;2为阳性对照，其模板为构建的重组表达载体;3为野生株对照，其模板为褐黄 孢链霉菌基因组;4，5，6为阳性转化子，其模板为相应转化子的基因组。
[0029]图4为褐黄孢链霉菌工程菌株与野生型菌株经摇瓶发酵后，其纳他霉素产量与菌 体干重的比值随时间变化图：从图中可以看出，褐黄孢链霉菌工程菌株合成纳他霉素的能 力强于野生型菌株，其中，（□)指代褐黄孢链霉菌(S.gilvosporeus S139);(A)指代褐黄 抱链霉菌工程菌株（S.gilvosporeus/pIMEP: :pimE: :vgb)〇
[0030] 图5为褐黄孢链霉菌工程菌株与野生型菌株摇床发酵后，取第4天的发酵液做的抑 菌圈实验。其中，左边为褐黄孢链霉菌（S. gi 1 vosporeus S139)，右边为褐黄孢链霉菌工程 菌株(S.gilvosporeus/pIMEP: :pimE: :vgb)。指示菌株为酵母菌。其结果与图4结果 一致。
[0031] 保藏信息
[0032] 分类名词：褐黄抱链霉菌Streptomyces gilvosporeus
[0033] 保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
[0034] 保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号 [0035] 保藏日期：2015年12月04日
[0036] 保藏号：CGMCC No .11790
[0037] 参据的生物材料(株）：S280
【具体实施方式】
[0038] 为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合【具体实施方式】 对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。
[0039] -、如图1所不，构建含有调控基因 pimM、胆固醇氧化酶基因 pimE和血红蛋白基因 vgb的表达载体pIMEP: :pimE: : vgb，引物序列为序列表〈400>4-〈400>15所示序列；
[0040] 二、构建含有表达载体pMEP: :pimE: :vgb的褐黄孢链霉菌工程菌株:该菌 株已被中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日：2015年12月04日保 藏号为:CGMCC No. 11790;
[0041 ]三、褐黄孢链霉菌工程菌株的发酵控制及纳他霉素含量的测定；
[0042] 本发明以褐黄孢链霉菌（Streptomyces gilvosporeus)菌株基因组为模板，将纳 他霉素生物合成基因簇中编码调控基因 pimM、编码胆固醇氧化酶基因 pimE、及外源透明颤 菌血红蛋白基因 vgb克隆到出发载体ρΙΜΕΡ上，使调控基因 pimM、胆固醇氧化酶基因 pimE、血 红蛋白基因 vgb位于该载体红霉素启动子Perm之后。经菌落PCR验证和酶切验证后，成功构 建表达载体pIMEP: :pimM/pIMEP: :pimE/pIMEP: :vgb。之后以表达载体pIMEP: :pimE为出发 载体，以表达载体ρΜΕΡ: :pimM为模板扩增基因 Perm: :pimM，用EcoRI单酶切构建重组表达 载体p頂EP: :pimE: :pimM。然后以表达载体p頂EP: :pimE: :pimM为出发载体，以表达载体 pIMEP: :vgb为模板扩增基因 Perm: :vgb，用Mun I/Spe I单酶切构建重组表达载体ρΙΜΕΡ:: pimE: :vgb。将该载体化转入大肠杆菌ETZ感受态细胞中。利用含有重组表达载体 pIMEP: :pimE: :vgb的大肠杆菌ETZ和褐黄孢链霉菌结合转移实验即可获得褐黄孢链 霉菌工程菌株3.8；[1￥08口0^118/^11^?:4；[11￡::口；[11^[::￥813。将获得的褐黄孢链霉菌工程菌 株进行摇床发酵试验，并取发酵液与甲醇以1:9比例混合，超声波超声20min后稀释适当倍 数，用HPLC法测定褐黄孢链霉菌工程菌株纳他霉素的产量。
[0043] 实施例1
[0044] 表达载体pIMEP: :pimE: :vgb的构建
[0045] (1)表达载体pBffiP: :pimE的构建
[0046] 以褐黄孢链霉菌(Streptomyces gilvosporeus)基因组为模板，利用表1的引物扩 增纳他霉素生物合成基因簇中胆固醇氧化酶基因 pimE，其下游引物pimE-R带有his标签。
[0047] 利用表1 的引物PCR扩增体系为：2XPCR Buffer(含Mg2+) 10μ1，dNTP(2.5πιΜ)2μ1，上 游引物pimE-F和下游引物pimE-R(lOyM)各ΙμL，模板(褐黄孢链霉菌基因组DNA)lyl，K0D Fx DNA(购自Τ0Υ0Β0公司，货号KFX-101)聚合酶0.5μ1，加无菌水至终体积为20μ1。
[0048] PCR反应条件为：94°C预变性2min，98°C变性15s，58°C退火30s，68°C延伸100s，反 应35个循环，68°C后延伸lOmin。
[0049] 表1所用引物序列
[0050]
[0051] 将已获得的DNA片段pimE用BamH I进行酶切，回收后与同样内切酶处理过的质粒 片段ρΜΕΡ进行连接。将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，并均匀涂布于带有阿普 霉素抗性（50μg/ml)的LB平板上，37 °C培养过夜，挑取单克隆，进行菌落PCR验证和酶切验 证，即可获得表达载体p IMEP: : p imE。
[0052] (2)表达载体pBffiP: :pimM的构建
[0053] 同样以褐黄孢链霉菌（Streptomyces gilvosporeus)基因组为模板，利用表2的引 物扩增纳他霉素生物合成基因簇中调控基因 pimM，其下游引物pimM-R带有his标签
[0054] PCR扩增体系为：2 XPCR Buffer(含Mg2+) 10μ1，dNTP(2 · 5πιΜ)2μ1，上游引物pimM-F 和下游引物PimM-R(1 ΟμΜ)各1 μ 1，模板（褐黄孢链霉菌基因组DNA) 1μ 1，K0D Fx DNA(购自 Τ0Υ0Β0公司，货号KFX-101)聚合酶0.5μ1，加无菌水至终体积为20μ1。
[0055] PCR反应条件为:94°C预变性2min，98°C变性15s，58°C退火30s，68°C延伸37s，反应 35个循环，68°C后延伸10min。
[0056] 表2所用引物序列
[0057]
[0058] 同样将已获得的DNA片段pimM用BamH I/EcoR I进行酶切，回收后与同样内切酶处 理过的质粒片段ρΜΕΡ进行连接。将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，并均匀涂布 于带有阿普霉素抗性(50μg/ml)的LB平板上，37 °C培养过夜，挑取单克隆，进行菌落PCR验证 和酶切验证，获得表达载体pMEP: :pimM。
[0059] (3)表达载体pIMEP: :pimE: :pimM的构建
[0060]以构建成功的表达载体pMEP: :pimM为模板，同时以构建成功的表达载体ρΠΙΕΡ:: pimE为出发载体。用表3的引物扩增Perm: :pimM基因。
[0061 ] PCR扩增体系为：2 XPCR Buffer(含Mg2+) 10μ1，dNTP(2 · 5πιΜ)2μ1，上游引物Perm-F 和下游引物PimM-R(1 ΟμΜ)各1 μ 1，模板（褐黄孢链霉菌基因组DNA) 1μ 1，KOD Fx DNA(购自 Τ0Υ0Β0公司，货号KFX-101)聚合酶0.5μ1，加无菌水至终体积为20μ1。
[0062] PCR反应条件为:94°C预变性2min，98°C变性15s，58°C退火30s，68°C延伸52s，反应 35个循环，68°C后延伸10min。
[0063] 表3所用引物序列
[0064]
[0066] 将已获得的DNA片段Perm: :pimM用EcoR I进行酶切，回收后与同样内切酶处理过 的质粒片段pMEP: :pimE进行连接。将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，并均匀涂 布于带有阿普霉素抗性(50μg/ml)的LB平板上，37 °C培养过夜，挑取单克隆，进行菌落PCR验 证和酶切验证，获得表达载体pIMEP: :pimE: :pimM。
[0067] (4)表达载体pBffiP: :vgb的构建
[0068] 以质粒载体puc57 : : vgb(pLH217)为模板，利用表4的引物扩增vgb基因，该基因携 带有his标签。
[0069] PCR扩增体系为：2 XPCR Buffer(含Mg2+) 10μ1，dNTP(2 · 5πιΜ)2μ1，上游引物vgb-F和 下游引物vgb-R(1 ΟμΜ)各1 μ 1，模板(褐黄孢链霉菌基因组DNA) 1 μ 1，KOD Fx DNA (购自Τ0Υ0Β0 公司，货号KFX-101)聚合酶0.5μ1，加无菌水至终体积为20μ1。
[0070] PCR反应条件为：94°C预变性2min，98°C变性15s，58°C退火30s，68°C延伸29s，反应 35个循环，68°C后延伸10min。
[0071] 表4所用引物序列
[0072]
[0073]将已获得的DNA片段vgb用Κρη I进行酶切，回收后与同样内切酶处理过的质粒片 段ρΜΕΡ进行连接。将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，并均匀涂布于带有阿普霉 素抗性(50μg/ml)的LB平板上，37 °C培养过夜，挑取单克隆，进行菌落PCR验证和酶切验证， 即可获得表达载体P MEP: : vgb。
[0074] (5)表达载体pIMEP: :pimE: :vgb的构建
[0075] 以构建成功的表达载体pMEP: :vgb为模板，同时以构建成功的表达载体ρΜΕΡ:: pimE: :pimM为出发载体。用表5的引物扩增Perm: :vgb基因。
[0076] PCR扩增体系为：2 XPCR Buffer(含Mg2+) 10μ1，dNTP(2 · 5πιΜ)2μ1，上游引物Perm-F 和下游引物vgb-R(lOyM)各ΙμL，模板（褐黄孢链霉菌基因组DNA)lyl，K0D Fx DNA(购自 Τ0Υ0Β0公司，货号KFX-101)聚合酶0.5μ1，加无菌水至终体积为20μ1。
[0077] PCR反应条件为:94°C预变性2min，98°C变性15s，58°C退火30s，68°C延伸43s，反应 35个循环，68°C后延伸lOmin。
[0078] 表5所用引物序列
[0079]
[0080] 将已获得的DNA片段Perm: :vgb用Mun I/Spe I进行酶切，回收后与同样内切酶处 理过的质粒片段pMEP: :pimE: :pimM进行连接。将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细 胞，并均匀涂布于带有阿普霉素抗性(50μg/ml)的LB平板上，37 °C培养过夜，挑取单克隆，进 行菌落PCR验证和酶切验证，获得表达载体pIMEP: :pimE: :vgb。
[0081] LB培养基：
[0082] 胰蛋白胨：10.0 g，酵母浸出物：5. Og，NaCl: 10.0 g，去离子水溶解后，定容至1.0L， pH调至7.0-7.2，固体培养基加1.5%的琼脂粉。121°C灭菌20min。
[0083] 实施例2
[0084] 含有表达载体pBffiP: :pimE: :vgb的褐黄孢链霉菌工程菌株的构建
[0085] 1.大肠杆菌-褐黄孢链霉菌的结合转移
[0086] (1)将验证正确的重组质粒pIMEP: :pimE: :vgb转化大肠杆菌ETZ感受态细 胞中，于37°C摇床中培养45min后，取100μ1发酵液均匀涂布于含有卡那霉素（终浓度为50μ g/ml)，四环素(终浓度为15μg/ml)，氯霉素(终浓度为25μg/ml)和阿普霉素(终浓度为50yg/ ml)抗性的LB平板上，待长出菌落后，挑取单克隆接于含有同样四种抗生素的液体LB培养基 中，进行菌落PCR验证和酶切验证。
[0087] (2)将验证正确的单克隆接于含有相同四种抗生素的液体LB培养基中，培养至 0D6QQ值在0.4和0.6之间。用1.5ml EP管收集菌体，用液体LB培养基洗涤菌体2-3次后，用 0.5ml LB液体培养基在1.5ml EP中悬浮菌体备用。
[0088] (3)用灭菌的棉签收集新鲜的褐黄孢链霉菌孢子于1.5ml EP管中，用0.5ml 2XYT 液体培养基中，50 °C水浴1 Omin，取出冷却至室温。
[0089] (4)混合处理好的大肠杆菌细胞和褐黄孢链霉菌孢子悬浮液，涂布MS(含5mM MgCl2)平板，于28°C培养箱培养16-20h，之后涂布lml无菌水(含萘啶酮酸0.4mg和阿普霉素 1.5mg)。于28°C继续培养至长有菌落。
[0090] (5)每个平板约长出50-200个转化子(图2)。转化子转接到带有阿普霉素抗性的SS 平板上。
[0091] 2.转化子的验证
[0092] 将得到的褐黄孢链霉菌工程菌株的转化子取新鲜孢子接种到种子培养基中，培养 两天后离心菌液提取基因组。以转化子的基因组为模板，野生型菌株的基因组为对照，表达 质粒pIMEP: :pimE: :vgb为阳性对照进行PCR验证。
[0093] PCR反应体系为：10XPCR Buffer 2yl，dNTP(10mM)0.4yl，上游引物pimE-F和下游 引物pimM_R( ΙΟμΜ)见表6各0 · 4μ1，模板ΙμL，Taq DNA聚合酶（购自Fermentas公司，货号 ΕΡ0405)0.4μ1，加无菌水至终体积为20μ1。
[0094] PCR反应条件为：94°C预变性5min，96°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸194s，反 应35个循环，72°C再延伸lOmin。
[0095] 表6所用引物序列
[0096]
[0097] 结果如图3所示，与褐黄孢链霉菌野生型菌株相比，重组表达载体pMEP: :pimE:: pimM: :vgb、褐黄孢链霉菌工程菌株能够扩增出3230bp的条带，说明重组表达载体ρΜΕΡ:: pimE: : vgb已经成功插入到褐黄孢链霉菌基因组中。其中，1指阴性对照，未加模板;2 为阳性对照，其模板为构建的重组表达载体pIMEP: :pimE: :vgb;3为野生株对照，其 模板为褐黄孢链霉菌基因组;4，5，6为阳性转化子，其模板为相应转化子的基因组。
[0098]培养基配方：
[0099] MS培养基：
[0100]甘露醇：20.Og;黄豆粉:20.0 g;琼脂：15.Og;去离子水溶解后，定容至1.0L<a2rC 灭菌20min。
[0101] 种子培养基：
[0102] 葡萄糖：20 · 0g，蛋白胨：6 · 0g，yeast extract: 6 · 0g，NaCl: 10 · 0g，去离子水溶解 后，定容至l.〇L，PH 7.0，121°C灭菌20min。
[0103] 实施例3
[0104] 褐黄孢链霉菌工程菌株的发酵控制及纳他霉素含量的测定
[0105] 1、褐黄孢链霉菌工程菌株的摇床发酵控制
[0106] 将筛选到的褐黄抱链霉菌工程菌株（Streptomyces gi 1 vosporeus/pIMEP :: pimE: : pimM: : vgb)CGMCC No · 11790和野生型菌株（S · gilvosporeus S139)均划线于SS平 板，在28°C培养8-12d。用无菌水洗取新鲜孢子，制备新鲜孢子悬浮液。把孢子悬液按2%-5%的接种量接种到装有20ml种子培养基的50ml的三角瓶中，28°C、200rpm培养2d。然后将 种子培养基按5%的接种量转接到盛有50ml发酵培养基的250ml三角瓶中，28°C、200rpm发 酵培养5d。
[0107] 2、褐黄孢链霉菌工程菌株5L发酵罐发酵控制
[0108] 将筛选到的褐黄抱链霉菌工程菌株（S.gilvosporeus /pIMEP: :pimE: :pimM:: vgb)和野生型菌株(S.gilvosporeu S139)均划线于SS平板，在28°C培养8-12d。用无菌水洗 取新鲜孢子，制备新鲜孢子悬浮液。把孢子悬液按2%_5%的接种量接种到装有150ml种子 培养基的500ml的三角瓶中，28°C、200rpm培养2d。然后将种子培养基按5%的接种量转接到 5L发酵罐中，发酵液总体积为3L。发酵初始通气量为4L/min，整个发酵过程中PH值控制在 6.0左右，温度为28°C。并且在30h时(发酵液残糖低于2% )，以每小时2.5g-3.0g的流速滴加 50%葡萄糖，108h时停止流加。在整个发酵过程中发酵过程控制如下所示：
[0109] (1) 0-7h转速为250rpm，通气量维持在4L/min;
[0110] (2) 7-8h转速为250rpm，通气量维持在6L/min;
[0111] (3) 8-12h 转速为 300rpm，通气量维持在 6L/min;
[0112] (4)12-16h 转速为 350rpm，通气量维持在 6L/min;
[0113] (5) 16-20h转速为至400rpm，通气量维持在6L/min;
[0114] (6) 20-24h 转速为450rpm，通气量维持在 6L/min;
[0115] (7) 24-30h 转速为 500rpm，通气量维持在 6L/min;
[0116] (8) 30-38h 转速为 550rpm，通气量维持在 6L/min;
[0117] (9) 38-50h 转速为600rpm，通气量维持在 6L/min;
[0118] (10) 50-58h 转速为625rpm，通气量维持在 6L/min;
[0119] (11) 58-120h 转速为650rpm，通气量维持在 6L/min。
[0120] 种子培养基：
[0121 ]葡萄糖：20 · 0g，蛋白胨：6 · 0g，yeast extract: 6 · 0g，NaCl: 10 · 0g，去离子水溶解 后，定容至 1.0L，pH 7.0，121°C灭菌20min。
[0122] 发酵培养基：
[0123] 葡萄糖:40.0g，大豆蛋白胨：15.0g，yeast extract: 5.0g，牛肉浸粉:5.0g，去离子 水溶解后，定容至1.0L，pH 7.5，121°C灭菌20min，其中葡萄糖配制浓度为50%，115°C灭菌 30min〇
[0124] SS培养基：
[0125] 葡萄糖：15.0区；蛋白胨：5.(^，76&8七6叉1^&(31: :3.(^，麦芽浸粉：3.(^，琼脂粉： 15.(^，去离子水溶解后，定容至1.01^，121<€灭菌2〇111；[11。
[0126] 3、发酵液中纳他霉素含量的测定
[0127] 发酵结束后，取lml发酵液与9ml甲醇混合，混匀，超声20min，之后8000r/min离心 15min，然后用0.22μπι的有机膜过滤得到待测样品，用HPLC定量分析纳他霉素。
[0128] HPLC分析条件：流动相：甲醇：水=70: 30;流速:0 · 700ml/min;检测波长为303nm; 进样量为1〇μ1;柱温为30°C。
[0129] 摇床数据如图4所示：褐黄孢链霉菌工程菌株（3.8；11￥〇8。〇代118/^11^?:4；[11^:: pimM: :vgb)与出发菌株(S.gilvosporeus S139)摇床发酵后的纳他霉素产量与菌体干重比 值随时间变化情况。从图4中可以看出褐黄孢链霉菌工程菌株（5411%叩0代1^/?1腿？：： pimE: :vgb)纳他霉素产量比野生株高，且在第4天时这种差异最为显著。计算结果表 明，褐黄孢链霉菌工程菌株（3.〖；11￥08卩0代118/卩11^::卩；[11￡::卩；[11^[::￥〖13)在第4天时其发酵 液单位菌体所产的纳他霉素较出发菌株提高了56%。由此证明他霉素生物合成基因簇中调 控基因 pimM和胆固醇氧化酶基因 pimE的置加效应以及外源基因 vgb的表达可明显提尚褐黄 孢链霉菌中纳他霉素的产量。图5为用第4天发酵液做的抑菌圈实验，其指示菌株为酵母菌。 该图更为直观的看出褐黄孢链霉菌工程菌株(S.gilvosporeus/pIMEP: :pimE: :vgb) 合成纳他霉素的能力高于野生株。野生菌株和工程菌株5L发酵罐培养后数据如表7所示，由 于pimM和pimE过表达及外源基因 vgb表达的叠加效应，工程菌株上罐发酵后纳他霉素产量 增加，其增长率在后期逐渐降低;但在120h时，其纳他霉素产量较野生菌株产量仍提高了 15.6%，达到10.136g/L。可见，由于三者之间的叠加效应，使纳他霉素合成时间大大缩短。
[0130] 表7出发菌株与工程菌株纳他霉素产量比较
[0131]
[0132] 上述参照【具体实施方式】对该褐黄孢链霉菌重组表达质粒及工程菌与应用进行的 详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不 脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种褐黄孢链霉菌重组表达质粒，其特征在于:是由调控基因 PimM、胆固醇氧化酶基 因 PimE和外源血红蛋白基因 vgb分别插入含有红霉素启动子的载体pMEP中得到的的重组 表达载体pIMEP: :pimE: :vgb，重组表达载体pIMEP: :pimE: :vgb的序列为序列 表〈400>17所示序列。2. -种含有权利要求1所述褐黄孢链霉菌重组表达质粒的工程菌，其特征在于:保藏号 为CGMCC No.11790。3. 权利要求2所述工程菌高产纳他霉素的应用。4. 根据权利要求3所述的工程菌的应用，其特征在于:包括补充碳源，调控通气量和搅 拌转速，发酵过程中30h-108h以2.5g/L-3g/L的流速流加50 %葡萄糖溶液;控制发酵液pH为 6;初始通气量为4L/min，7h升至6L/min;在相应的不同时间点调节转速，至58h调至650rpm 后不再变化。
【文档编号】C12P19/62GK105907778SQ201610203779
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年3月31日
【发明人】刘浩, 孙春杰, 何希宏, 王海霞
【申请人】天津科技大学