专利名称：：达托霉素生产菌玫瑰孢链霉菌的代谢网络分析方法
技术领域：
：本发明属于代谢工程领域，特别涉及达托霉素生产菌玫瑰孢链霉菌的代谢网络分析方法。
背景技术：
："玫瑰孢链霉菌"(拉丁名称为"Str印tomycesroseosporus")是一种链霉菌属的放线菌，其生长指数增长后期到稳定期合成的达托霉素(英文名"d即tomycin")为N_癸酰-L-色氨酰-L-天冬酰胺酰-L-天冬氨酰-L-苏氨酰-甘氨酰-L-鸟氨酰-L-天冬氨酰-D-丙氨酰-L-天冬氨酰-甘氨酰-D-丝氨酰-L-threo-3-甲基-谷氨酰_L_犬尿氨酰el-内酯，是由-个十碳烷侧链与-个环状13氨基酸肽链N-末端的色氨酸连接而成，是一种新型脂肽类抗生素。达托霉素是一种钙离子依赖型的抗生素，在钙离子存在的条件下，达托霉素以非共价键的形式结合到细胞膜蛋白上，细胞膜上的达托霉素结合蛋白为其作用靶位，达托霉素可扰乱细胞膜对氨基酸的转运，从而阻碍细菌细胞壁肽聚糖的磷壁酸脂质的生物合成，改变细胞质膜的性质；另外，它还能通过破坏细菌的细胞膜，使其内容物外泄而达到杀灭细菌的目的。也有报道是其与细胞膜的结合，导致膜电位的降低，从而破坏胞内RNA和DNA的合成，最终抑制细菌生长。达托霉素由于独特的结构特征和作用机理，对于耐药菌，如耐万古霉素的肠球菌，耐甲氧西林的金葡菌，糖肽类敏感的金葡菌，凝固酶阴性的葡萄球菌和耐青霉素的肺炎链球菌的感染具有显著的治疗效果。是继万古霉素之后一种新型的抗生素，在治疗皮肤感染和心膜炎方面有着显著的疗效。2003年达托霉素成为第一个被美国FDA批准上市的首个脂肽类抗生素。2006年，达托霉素再次获得了欧洲药品评价署在整个欧洲的认证。对生物代谢网络的研究日益受到人们的重视，主要是生物中的各组分成分的功能都是通过与其他部分的相互作用体现出来的，因此只有在系统水平上对所有成分进行整体分析才能对生物的生理功能有全面正确的了解。利用所构建的代谢网络模型，通过代谢通量分析，可以求得胞内物质代谢的分布情况。对于达托霉素的生产菌玫瑰孢链霉菌，目前还没有对其代谢网络分析的报道，因此构建玫瑰孢链霉菌的代谢网络模型，计算其胞内的代谢通量分布，能够更好地了解该菌种的代谢特性。
发明内容本发明的目的是应用构建的玫瑰孢链霉菌的代谢网络模型计算碳代谢分布的方法，通过测量胞外反应的通量，计算出代谢网络模型中各胞内反应的代谢通量。达托霉素生产菌玫瑰孢链霉菌的代谢网络分析方法如下1)根据糖酵解途径、戊糖磷酸途径、柠檬酸循环、回补反应和细胞合成反应的达托霉素合成反应，构建出中心代谢网络模型；2)将代谢网络模型转化为矩阵S(mXn)，其中m为胞内代谢物，n为反应，S(m，n)表示代谢物m在反应n中的计量系数，且有V表示反应通量(n维向量)，在稳态条件下胞内代谢物的累积速率为O，则有SJC+SKVK=O，其中下标C表示未知通量，K表示已知通量，未知通量由公式V^-(S^)—SVk求出；3)将玫瑰孢链霉菌在发酵罐中进行恒化培养，收集发酵液，测量细胞干重、葡萄糖消耗速率、达托霉素生成速率和细胞生长速率；4)将步骤3中测得的葡萄糖消耗速率、达托霉素生成速率和细胞生长速率分别除以细胞干重，得到比葡萄糖消耗速率、比达托霉素生成速率和比细胞生长速率，则为3个已知通量，带入步骤2中的公式，求出未知通量。本发明将代谢网络分析技术应用于玫瑰孢链霉菌的代谢通量分析，通过测量胞外物质的代谢通量，计算得到胞内反应的代谢通量，反应出葡萄糖被菌体利用后在糖酵解途径、戊糖磷酸途径、柠檬酸循环和回补反应的分布情况，为定量化研究玫瑰孢链霉菌胞内的代谢特性提供了一个新的方法。图1为实施例1中构建的代谢网络示意图。图2为实施例1中矩阵S、Sc和SK以及向量V、Vc和Vk的示意圉。具体实施例方式下面结合具体的实施例对本发明做进一步说明实施例1:根据生物化学中关于代谢反应的知识，构建中心碳代谢网络，包括糖酵解途径、戊糖磷酸途径、柠檬酸循环、回补反应、细胞合成反应和达托霉素合成反应；根据达托霉素的氨基酸组成和合成这些氨基酸的前体物质，将达托霉素表示为由前体物质合成，氨基酸合成的前体物质参照St印hanopoulos等人所著的《代谢工程_原理与方法》(赵学明等译，化学工业出版社，1998);细胞的前体物质组成参照Schilling等人在《BiotechnologyandBioengineering》(Vol.71:286-306，2001)发表的"Combiningpathwayanalysiswithfluxbalanceanalysisforthecomprehensivestudyofmetabolicsystems，，，得到的代谢网络包括15个胞内代谢物和18个反应。表1代谢网络反应列表反应编号'反应i葡萄糖(胞外)一6-磷酸葡萄糖426-磷酸葡萄糖^6-磷酸果糖36-磷酸果糖^2X3-磷酸甘油醛43-磷酸甘油醛一3-磷酸甘油酸53-磷酸甘油酸^磷酸烯醇式丙酮酸6磷酸烯醇式丙酮酸一丙酮酸76-磷酸葡萄糖一5-磷酸核酮糖85-磷酸核酮糖e5-磷酸木酮糖95-磷酸核酮糖^5-磷酸核糖105-磷酸木酮糖+5-磷酸核糖o3-磷酸甘油醛+7-磷酸景天庚酮糖117-磷酸景天庚酮糖+3-磷酸甘油醛^6-磷酸果糖+4-磷酸赤藓糖12磷酸烯醇式丙酮酸一草酰乙酸13丙酮酸一乙酰辅酶A14乙酰辅酶A+草酰乙酸一柠檬酸15柠檬酸一a-酮戊二酸16a-酮戊二酸一草酰乙酸丙酮酸+4X磷酸烯醇式丙酮酸+3X3-磷酸甘油酸+5X草酰乙酸+217Xa-酮戊二酸+2X4-磷酸赤藓糖+2X5-磷酸核糖+癸酸(胞外)一达托霉素(胞外)0.2X6-磷酸葡萄糖+0.1X6-磷酸果糖+0.9X5-磷酸核糖+0.4X4-8磷酸赤藓糖+0.1X3-磷酸甘油醛+1.5X3-磷酸甘油酸+0.5X磷酸烯醇式丙酮酸+2.8X丙酮酸+3.7X乙酰辅酶八+1.8X草酰乙酸+1.1__Xa-酮戊二酸一细胞_表1中，"一"表示不可逆反应，"^，，表示表示可逆反应，反应18中"细胞"的单位为1/h，所有其它反应物的单位为mmol/(g细胞干重h);反应1为葡萄糖活化反应，反应2-6为糖酵解途径，反应7-11为磷酸戊糖途径，反应12为回补反应，反应13-16为柠檬酸循环，反应17为达托霉素合成反应，反应18为细胞合成反应。图1中V1-V18分别为表1中反应1-18的代谢通量，V17和V18的"前体物质"的见表1中的反应17和18。表2为实施例1中代谢网络的胞内代谢物列表。其中代谢物为表1所列反应中胞内的代谢物质，共有15个。表2代谢网络中胞内代谢物列表编号胞内代谢物16-磷酸葡萄糖26-磷酸果糖33-磷酸甘油醛43-磷酸甘油酸5磷酸烯醇式丙酮酸6丙酮酸75-磷酸核酮糖85-磷酸木酮糖95-磷酸核糖107-磷酸景天庚酮糖114-磷酸赤藓糖12草酰乙酸13乙酰辅酶A14柠檬酸52.将构建的代谢网络转化为矩阵S(mXn)，其中m为胞内代谢物(15个)，n为反应(18个)，S(m，n)表示代谢物m在反应n中的计量系数，矩阵的自由度为n-m=3，已知通量有反应1、17和18的代谢通量共3个，自由度=已知通量个数，为正定矩阵；未知通量为反应2，3…16的代谢通量，用下列公式求解Vc—(S^)—'S;Vk其中V表示反应通量，上标T表示转置矩阵，下标C表示未知通量，K表示已知通量。如图2所示，其中图(1)-(6)分別表示S、Sc、Sk、V、Vc和Vk，圉中(1)_(3)的横坐标1-18分别表示表1中的反应1-18，纵坐标1-15分别表示表2中胞内代谢物1-15。3.在室温下将玫瑰孢链霉菌在3升自动发酵罐进行恒化培养，装液量为2升，控制pH7.0，温度3(TC，转速400rpm，通气量0.8vvm，以2ml/h的速度向发酵罐中流加癸酸氨水(体积比2:1)溶液，并以48ml/h的速度流加发酵培养基，同时以50ml/h的速度从发酵罐中抽取发酵液，保持发酵罐中液量的稳定。发酵培养基的组成及质量含量为葡萄糖40g/l，MgS047H20lg/l，K2HP043H202g/l，CaCl22H20lg/l，FeS047H200.05g/l，pH7.0。测量的葡萄糖消耗速率、细胞生长速率、达托霉素生成速率和细胞干重分别为2.285,1/(1h)、0.251g/(lh)、0.001,1/(1h)和5.02g/l。4.将步骤3中测得的葡萄糖消耗速率、细胞生长速率和达托霉素生成速率分别除以细胞干重，得到比葡萄糖消耗速率、比达托霉素生成速率和比细胞生长速率分别为0.4552,1/(g细胞干重h)、0.0002,1/(g细胞干重h)和0.051/h，分别为VI，V17和V18，带入步骤2中的公式，求出未知通量V2，V3…V16。表3为实施例1中计算得到的代谢通量，其中反应1-18分别对应表1中的反应，反应1-17的代谢通量单位为mmol/(g细胞干重h)，反应18的代谢通量单位为l/h。表3实施例1中计算得到的代谢通量分布<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>权利要求达托霉素生产菌玫瑰孢链霉菌的代谢网络分析方法，其特征是1)根据生物化学中代谢反应原理、细胞组成和达托霉素分子组成，构建出中心代谢网络；2)将代谢网络转化为矩阵S(m×n)，其中m为胞内代谢物，n为反应，S(m，n)表示代谢物m在反应n中的计量系数，且有V表示反应通量(n维向量)，在稳态条件下胞内代谢物的累积速率为0，则有SCVC+SKVK＝0，其中下标C表示未知通量，K表示已知通量，未知通量由公式求出；3)将玫瑰孢链霉菌在发酵罐中进行恒化培养，收集发酵液，测量细胞干重、葡萄糖消耗速率、达托霉素生成速率和细胞生长速率；4)将步骤3中测得的葡萄糖消耗速率、达托霉素生成速率和细胞生长速率分别除以细胞干重，得到比葡萄糖消耗速率、比达托霉素生成速率和比细胞生长速率，则为3个已知通量，带入步骤2中的公式，求出未知通量。FSA00000026726700011.tif2.根据权利要求1所述代谢网络分析方法，其特征在于，构建的代谢网络模型包括糖酵解途径、戊糖磷酸途径、柠檬酸循环、回补反应、细胞合成反应和达托霉素合成反应。3.根据权利要求1所述代谢网络分析方法，其特征在于，矩阵S由15个胞内代谢物和18个反应组成，矩阵的自由度为3。全文摘要发明涉及达托霉素生产菌玫瑰孢链霉菌的代谢网络分析方法。1)根据糖酵解途径、戊糖磷酸途径、柠檬酸循环、回补反应和细胞合成反应的达托霉素合成反应，构建出中心代谢网络模型；2)将代谢网络模型转化为矩阵S(m×n)，收集发酵液，测量细胞干重、葡萄糖消耗速率、达托霉素生成速率和细胞生长速率；根据已知通量，求出未知通量。本发明将代谢网络分析技术应用于玫瑰孢链霉菌的代谢通量分析，通过测量胞外物质的代谢通量，计算得到胞内反应的代谢通量，反应出葡萄糖被菌体利用后在糖酵解途径、戊糖磷酸途径、柠檬酸循环和回补反应的分布情况，为定量化研究玫瑰孢链霉菌胞内的代谢特性提供了一个新的方法。文档编号G06F19/00GK101777094SQ20101010347公开日2010年7月14日申请日期2010年2月1日优先权日2010年2月1日发明者王国英,贾晓强,闻建平,黄笛申请人:天津大学