专利名称：玫瑰孢链霉菌基因工程菌hp-orf53-55的构建方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明基因工程和微生物发酵技术领域，具体涉及一种玫瑰孢链霉菌基因工程菌 HP-0RF53-55的构建方法及其在生产达托霉素中的应用。
背景技术：
达托霉素是一种钙离子依赖型的抗生素，在钙离子存在的条件下，达托霉素将以非共价键的形式结合到细胞膜蛋白上，细胞膜上的达托霉素结合蛋白(DBPs)为其作用靶位，达托霉素可扰乱细胞膜对氨基酸的转运，从而阻碍细菌细胞壁肽聚糖的磷壁酸脂质 (LTA)的生物合成，改变细胞质膜的性质；另外，它还能通过破坏细菌的细胞膜，使其内容物外泄而达到杀灭细菌的目的。也有报道是其与细胞膜的结合，导致膜电位的降低，从而破坏胞内RNA和DNA的合成，最终抑制细菌生长。达托霉素由于独特的结构特征和作用机理， 对于耐药菌，如耐万古霉素的肠球菌(VRE)，耐甲氧西林的金葡菌(MRSA)，糖肽类敏感的金葡菌(GISA)，凝固酶阴性的葡萄球菌(CNQ和耐青霉素的肺炎链球菌(PRSP)的感染具显著的治疗效果。是继万古霉素之后一种新型的抗生素，在治疗皮肤感染和心膜炎方面有着显著的疗效。2003年和2006年达托霉素(Daptomycin，LY14603》先后被美国FDA和了欧洲药品评价署(EMEA)的认证和批准上市。尽管国内已经有生产达托霉素的菌种，以初步实现中试生产，但是菌种原始，达托霉素的产量低，生产成本很高，因此通过基因工程技术选育高产优良菌株，进一步提高达托霉素的产量，具有重要的经济价值和社会意义。
发明内容
本发明提供一种达托霉素的基因工程菌HP-0RF53-55的构建方法，与出发菌株相比实例菌株的达托霉素产量的到了显著提高。ATP结合转运蛋白(ABC转运蛋白是缩写名词)，利用水解ATP获得能量来跨膜转运多种底物和脂类、留醇、抗生素等次级代谢产物，广泛分布于抗生素合成基因簇中，对于抗生素的分泌，自抗性和抗生素合成调控有着重要作用。ABC转运蛋白在链霉菌的形态分化和抗生素合成中有着重要的作用，敲除相应的ABC转运蛋白后，会大大降低抗生素的分泌效率，造成抗生素在细胞内的积累，使细胞对自产抗生素的耐受性降低，对抗生素的合成造成严重的产物抑制作用。达托霉素由非核糖体蛋白合成酶(NRPQ指导合成的大环内酯类脂肽抗生素，分子结构复杂(分子量高达1620. 6Da)，合成基因簇中包含64个0RF，合成机理复杂，调控机制严格。位于NRPS基因下游的0RF53，ORFM和0RF55，分别被预测为ABC 转运蛋白的周质成分和ABC转运蛋白透性酶。这三个基因编码ABC转运蛋白的基因最临近 NRPS基因，因此0RF53，0RFM和0RF55编码的ABC转运蛋白对达托霉素的跨膜转运和合成调控起着重要的作用。过表达0RF53，0RFM和0RF55，可促进达托霉素的分泌效率提高，降低达托霉素在细胞内的积累，减小对自身细胞的毒害，降低达托霉素合成的产物抑制作用。 从而可以使达托霉素的产量有显著的提高。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的达托霉素基因工程菌的构建方法，利用PCR扩增基因0RF53，ORFM和0RF55 (这三个基因在基因组上是连续，作为整体克隆表达)。将基因片段连接到过表达载体，然后利用结合转移的方法转化玫瑰孢链霉菌，通过抗生素抗性筛选获得目的基因工程菌。所述表达载体为整合型载体。所述表达载体中NRPS附属基因的启动子为ermE* ； 表述载体的出发载体为PIB139。达托霉素基因工程菌的构建方法，步骤如下(1)设计 PCR 引物扩增基因 0RF53，0RF54 和 0RF55 ；(2)将克隆得到的目的基因插入PIB139的组成型强启动子ermE*下游多克隆位占.
^ \\\ (3)然后将重组质粒导入大肠杆菌ET12567中，以备结合转移之用；(4)将大肠杆菌ET12567与玫瑰孢链霉菌在MS培养基上37°C共培养20小时，然后用含有萘啶酮酸(25yg/ml)和安普霉素(50yg/ml)的无菌水将平板覆盖，再在30°C培养48小时，筛选转化子。(5)提取筛选的转化子的基因组，用PCR验证转化子达托霉素基因工程菌的应用，其特征是(1)在室温下取玫瑰孢链霉菌Sti^ptomyces roseosporus基因工程菌 HP-0RF53-55的斜面孢子用无菌水制成孢子悬液；(2)取0. 5毫升孢子悬液接种到装有30毫升种子培养基的250毫升的摇瓶中， 300C，180 220rpm摇床中培养48小时，制备种子液；(3)以 4%的接种量，接种到7. 5L自动发酵罐中，在发酵培养中30°C培养， 在0 30h,控制pH 6. 5，溶氧45 % ；在30h 144h，控制pH 7.0,通气量控制0. 8v/v/m, 30h时以0. 10mL/h的速度开始流加1 1的癸酸和油酸甲酯溶液，并在开始补加甘油， 流速为0. 25mL/L · h，发酵144小时；(4)通过HPLC检测发酵液中的达托霉素浓度。所述的培养基组成及质量含量为种子液体培养基组成及质量含量为糊精lg，葡萄糖0. 5g，蛋白胨0. 5g，酵母浸粉 0. 5g, K2HP04 · 3H20 0. 05g, MgS04 · 7H20 0. 05，CaC03 0. 02g，溶解到 IL 蒸馏水中，初始 ρΗ7· 0。所述的发酵培养基组成及质量含量为葡萄糖1. Og/L，糊精3g/L，干酪素1. 0g/L, 花生饼粉 0. 6g/L，L-天冬素 0. 12g/L，K2S04 0. 6g/L，初始 pH 7. 0o本发明的达托霉素基因工程菌，为玫瑰孢链霉菌(Str印tomyces roseosporus) HP-0RF53-55,已经于2010年8月23日，在北京市朝阳区北辰西路1号院3号的保藏于中国微生物菌种保藏管理中心进行了保藏，保藏编号分别为CGMCC No. 4097。本发明的效果和作用是本发明提供了能提高达托霉素产量的基因工程菌的构建方法。属于基因重组技术。该方法包括以下过程克隆达托霉素合成基因簇中非核糖体蛋白合成酶(NRPQ下游的 ABC转运蛋白编码基因0RF53，0RF54和0RF55 (如图1)，利用大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒表达载体构建重组质粒。将重组质粒导入大肠杆菌ET12567中，将ET12567与玫瑰孢链霉菌共培养，通过结合转移的方法转化玫瑰孢链霉菌，然后通过安普霉素抗性筛选转化子，通过 PCR进一步确认。本发明构建的玫瑰孢链霉菌基因工程菌可直接用于达托霉素的工业化生产，可提高产量25%，并可有利于降低分离纯化难度和提高收率，从而显著降低达托霉素生产成本。
图1 达托霉素结构及非核糖体蛋白合成酶(NRPQ基因簇示意图；图2 过表达重组载体构建流程。
具体实施例方式实施例1基因工程菌HP-0RF53-55 的构建(CGMCC 4097)设计引物PCR克隆0RF53-55。(上下游引物分别为上引GAAGGAAACATATGGTGCTCGGCT (下戈Ij 线为NdeI酶切位点)；下弓丨 GTACAATCTAGATCACTTGACGCTCCCTG (下划线为XbaI酶切位点)。将PCR产物和表达载体 PIB139分别用Ndel/Xbal双酶切，回收后，将0RF53-55和pIB139以3 1 1 1的比例用T4连接酶在16°C连接2小时构建重组表达载体pAB139(如图2)，然后用热激法导入 ET12567大肠杆菌感受态细胞，在LB培养基活化培养一小时后涂到安普霉素筛选平板。然后挑取转化子提取质粒严证。然后用结合转移的方法将重组表达载体PAB139导入玫瑰孢链霉菌。具体步骤如下(1)将ET12567单克隆挑进IOml含50 μ g/ml氯霉素，50μ g/ml卡那霉素，50 μ g/
ml的安普霉素过夜培养(2)取Iml过夜培养的菌液接种到50ml含氯霉素，卡那霉素，安普霉素各50mg/ml 的培养基中，37°C培养到OD值达到0. 5-0. 8 ；(3)用等体积的不含抗生素的LB培养基清洗2次，重悬于0. 1体积的LB培养基中；(4)在洗大肠杆菌的同时，加大概108个链霉菌的孢子于500 μ 1的2ΧΥΤ培养基中，50°C下热击10分钟，然后37°C活化2小时；(5)加500 μ 1大肠杆菌细胞于0. 5ml的热击过的孢子或菌丝体中，快速混合，离
心。扔掉大部分上清液，重悬细胞；(6)将混合细胞涂布于含0. 01mol/LMgC12的MS琼脂培养基上，30°C培养16_20h， 在涂布之前将MS板于超净风中吹lh，有利于吸掉下一步涂布的水；(7)用含0. 5mg的萘啶酮酸和Img安普霉素的水覆盖；(8)挑选转化子于选择性高氏一号培养基上(含有50 μ g/ml安普霉素和25 μ g/ ml的萘啶酮酸)。(9)结合转移菌株的筛选结合转移LB平板上生长2天后，得到了结合转化子， 接菌到含50ug/ml的安普霉素和萘啶酮酸的高氏一号选择培养基上，基本确认为接合转移株，但尚需进一步验证，准备接种到液体培养基上培养，提取基因组，利用与载体PIB139多克隆位点两侧序列互补的引物进行PCR验证。所用的测序引物序列上引TTGCGCCCGATGCTAGTCG ；下弓丨 GCACGACAGGTTTCCCGACTG最后将筛选获得的0RF53-55过表达基因工程菌命名为HP-0RF53-55。发酵应用在室温下取玫瑰孢链霉菌S. roseosporus HP-0RF53-55的斜面孢子用无菌水制成孢子悬液；然后取0. 5毫升孢子悬液接种到装有30毫升种子培养基的250毫升的摇瓶中， 30°C，180 220rpm摇床中培养48小时；然后以1 % 4%的接种量，接种到7. 5L自动发酵罐中；然后，30°C，在0 30h，控制pH 6. 5，溶氧45% ；30h 144h，控制pH 7.0，通气量控制0. 8v/v/m, 30h时以0. 10mL/h的速度开始流加1 1的癸酸和油酸甲酯溶液，并在
开始补加甘油，流速为0. 25mL/L *h，发酵144小时。通过HPLC监测发酵液中的达托霉素浓度。达托霉素发酵产量达到698mg/L，比出发菌株提高了 25%。
权利要求
1.达托霉素基因工程菌的构建方法，其特征是利用PCR扩增NPRS下游ATP结合转运蛋白编码基因0RF53，0RFM和0RF55，将基因片段连接到过表达载体，然后利用结合转移的方法转化玫瑰孢链霉菌，通过抗生素抗性筛选获得目的基因工程菌。
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征是所述表达载体为整合型质粒载体。
3.如权利要求1或2所述的构建方法，其特征是所述表达载体中启动子为ermE*；表述载体的出发载体为PIB139。
4.如权利要求1所述的构建方法，其特征是步骤如下(1)设计PCR引物扩增NPRS下游ATP结合转运蛋白编码基因0RF53，0RF54和0RF55；(2)将克隆得到的目的基因插入PIB139的组成型强启动子ermE*下游多克隆位点；(3)然后将重组质粒导入大肠杆菌ET12567中，以备结合转移之用；(4)将大肠杆菌ET12567与玫瑰孢链霉菌在MS培养基上37°C共培养20小时，然后用含有萘啶酮酸(25μ g/ml)和安普霉素(50μ g/ml)的无菌水将平板覆盖，再在30°C培养48 小时，筛选转化子；(5)提取筛选的转化子的基因组，用PCR验证转化子。
5.达托霉素基因工程菌的应用，其特征是(1)在室温下取玫瑰孢链霉菌Mi^ptomycesroseosporus基因工程菌HP-0RF53-55的斜面孢子用无菌水制成孢子悬液；(2)取0.5毫升孢子悬液接种到装有30毫升种子培养基的250毫升的摇瓶中，30°C， 180 220rpm摇床中培养48小时，制备种子液；(3)以1% 4%的接种量，接种到7. 5L自动发酵罐中，在发酵培养中30°C培养，在0 30h，控制pH 6. 5，溶氧45% ；在30h 144h，控制pH 7. 0，通气量控制0. 8v/v/m，30h时以 0. 10mL/h的速度开始流加1 1的癸酸和油酸甲酯溶液，并在开始补加甘油，流速为 0. 25mL/L · h，发酵 144 小时；(4)通过HPLC检测发酵液中的达托霉素浓度。
6.如权利要求5所述的应用，其特征是所述的培养基组成及质量含量为种子液体培养基组成及质量含量为糊精lg，葡萄糖0. 5g，蛋白胨0. 5g，酵母浸粉0.5g，K2HPO4 · 3H20 0. 05g，MgSO4 · 7H20 0. 05，CaCO3 0. 02g，溶解到 IL 蒸馏水中，初始 pH 7. 0。
7.如权利要求5所述的应用，其特征是所述的发酵培养基组成及质量含量为葡萄糖1.Og/L,糊精 3g/L，干酪素 1. 0g/L，花生饼粉 0. 6g/L，L-天冬素 0. 12g/L，K2SO4 0. 6g/L，初始 pH 7. 0。
8.达托霉素基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌为玫瑰孢链霉菌(Sti^ptomyces roseosporus)HP-0RF53-55,保藏于中国微生物菌种保藏管理中心，保藏编号分别为CGMCC No.4097。
全文摘要
本发明提供了玫瑰孢链霉菌基因工程菌的构建方法及其应用，克隆达托霉素合成基因簇中非核糖体蛋白合成酶(NRPS)基因下游编码ATP结合转运蛋白的三个关键基因ORF53-55，利用大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒表达载体构建重组质粒。将重组质粒导入大肠杆菌ET12567中，将ET12567与玫瑰孢链霉菌共培养，通过结合转移的方法转化玫瑰孢链霉菌，然后通过安普霉素抗性筛选转化子，通过PCR对基因工程菌进一步验证。本发明构建的玫瑰孢链霉菌基因工程菌可直接用于达托霉素的工业化生产，可提高产量降低成本。
文档编号C12R1/465GK102260700SQ201110190188
公开日2011年11月30日 申请日期2011年7月8日 优先权日2010年9月24日
发明者宇光海, 贾晓强, 闻建平 申请人:天津大学