一种生产白桦脂酸的酿酒酵母工程菌及其构建方法
【专利摘要】本发明涉及一种酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述酿酒酵母工程菌为以酿酒酵母株系WAT11为基础，基因组中整合了LUP基因表达框和BPLO基因的表达框，所述酿酒酵母工程菌优选被敲除了GAL80基因。本发明还涉及构建所述酵母工程菌的方法，以及使用所述酵母工程菌生产白桦脂酸的方法。通过本发明，可使用酿酒酵母，通过微生物发酵的方式来生产白桦脂酸，操作简单，产量高，生产周期短，占地小。
【专利说明】
一种生产白桦脂酸的酿酒酵母工程菌及其构建方法
技术领域
[0001] 本发明涉及微生物的遗传改造，更特别地，涉及一种生产白桦脂酸的酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)工程菌及其构建方法。
【背景技术】
[0002] 白桦脂酸(Betulinic acid，BA)，又称桦木酸，是一种五环三砲类化合物。五环三 萜类化合物是一类非常重要的植物次生代谢产物，这类化合物通常具有十分广泛的药理作 用和生物活性。这类化合物广泛存在于植物界中，而且包含的类型数目较多，主要的五环三 萜化合物有齐墩果烷型，乌苏烷型，羽扇豆烷型和木栓烷型几种类型，而白桦脂酸是羽扇豆 烷型五环类三萜化合物的典型代表。
[0003] 近年来的大量研究表明，白桦脂酸有着显著的药理作用和生物活性，主要体现在 抗肿瘤、抗HI V、抗炎、抗菌以及抗疟疾等方面的作用。白桦脂酸表现出的以上生物活性(特 别是对人类黑色素瘤细胞的选择性杀伤作用以及抗HIV-1型感染的抑制作用）加上其作用 机制特异以及较高的安全性等特点，使其成为非常具有研究价值的天然产物，具有十分广 泛的应用开发前景。目前白桦脂酸的主要来源是从白桦树的树皮中直接提取与纯化，存在 着资源浪费严重的问题。通过生物工程的方法，以微生物为生物容器来合成这类化合物具 有广阔的前景。
[0004] 酿酒酵母是第一个基因组完成测序的真核生物，被作为真核模式生物，其表达调 控机理比较明确并且具有遗传操作简单、繁殖速度快、安全可靠等特点，常被用作大规模生 物发酵的真核表达菌株。酿酒酵母菌株WAT11是实验室常用的酿酒酵母菌株，是在野生型株 系W303中整合了拟南芥还原酶基因 ATR1而来（Urban P，Mignotte C，Kazmaier M，et al.Cloning,yeast expression, and characterization of the coupling of two distantly related Arabidopsis thaliana NADPH-cytochrome P450reductases with P450CYP73A5[J],Journal of Biological Chemistry,1997,272(31):19176-19186)〇
[0005] 白桦脂酸是通过三萜类共同前体物质2,3_氧化鲨烯烃过羽扇豆醇合酶以及C-28 位单加氧的P450分子的作用生成。WAT11自身能产生三萜类物质合成的前体物质2、3_氧化 鲨烯，而且具有P450分子作用所需的还原酶。因此，发明人期望以WAT11为基础，通过分子生 物学手段和遗传工程技术，构建一种生产白桦脂酸酿酒酵母工程菌。
【发明内容】
[0006] 为解决以上技术问题，本发明提供了一种酿酒酵母工程菌，所述酿酒酵母工程菌 为以酿酒酵母株系WAT 11为基础，基因组中整合了 LUP基因表达框和BPL0基因表达框，其中 所述LUP基因表达框由LUP基因有效连接于第一可诱导启动子而形成，所述LUP基因的序列 如SEQ ID N0:1所示，所述BPL0基因表达框由BPL0基因有效连接于第二可诱导启动子而形 成，所述BPL0基因的序列如SEQ ID N0:2所示。这里的有效连接是指基因位于启动子的下游 并由启动子控制转录。
[0007] 优选地，所述第一可诱导启动子为GAL1启动子，序列如SEQ ID NO:3所示。
[0008] 优选地，所述第二可诱导启动子为GAL10启动子，序列如SEQ ID N0:4所示。
[0009] 优选地，所述工程菌的GAL80基因被部分或全部敲除，所述GAL80基因的序列如SEQ ID NO: 16所示。
[0010] 本发明还提供了一种构建酿酒酵母工程菌的构建方法，包括以下步骤：
[0011] 1)将LUP基因顺着GAL1启动子的方向插入到PESC-Trp载体的GAL1启动子的下游， 使所述LUP基因处于所述GAL1启动子的控制下，并且将BPL0基因顺着GAL10启动子的方向插 入到所述PESC-Trp载体的GAL10启动子的下游，使所述BPL0基因处于所述GAL10启动子的控 制下，从而得到集成了 LUP基因表达框和BPL0基因表达框的质粒PESC-TRP-LUP-BPLO，其中 所述LUP基因的序列如SEQ ID N0:1所示，所述GAL1启动子的序列如SEQ ID N0:3所示，所述 BPL0基因的序列如SEQ ID N0:2所示，所述GAL10启动子的序列如SEQ ID N0:4所示；
[0012] 2)通过定点突变的方法将所述质粒PESC-TRP-LUP-BPLO中所述LUP基因中GATATC 中的胞嘧啶突变为胸腺嘧啶；
[0013] 3)用EcoRV酶切步骤2)中得到的突变的质粒PESC-TRP-LUP-BPLO，使其线性化，然 后将所述线性化的质粒PESC-TRP-LUP-BPLO转入酿酒酵母WAT11中，通过酵母菌体内自动发 生的同源重组使所述LUP基缺失了因表达框和所述BPL0基因表达框整合至所述酵母菌的基 因组中；
[0014] 4)将由以5'至3'方向排列的GAL80基因 5'区序列+loxP-KanMX-loxP+GAL80基因 3' 区序列组成的GAL80基因敲除框转化至步骤3)中得到的基因组中整合了所述LUP基因表达 框和所述BPL0基因表达框的酿酒酵母中，通过细胞内自动发生的同源重组使所述酿酒酵母 中的GAL80基因的相应位置被所述GAL80基因敲除框替换，所述GAL80基因敲除框的序列如 SEQIDN0:5**;
[0015] 5)将Cre重组酶转化至步骤4)得到的GAL80基因被敲除的酿酒酵母中，使所述片段 再次发生重组，丢失所述loxP-KanMX-loxP片段，从而得到具有所述LUP基因表达框和所述 BPL0基因表达框并且缺失了所述Gal 80基因编码框的酿酒酵母工程菌。
[0016] 本发明还提供了一种生产白桦脂酸的方法，包括以下步骤：
[0017] 1)培养上述酿酒酵母工程菌至对数期；
[0018] 2)诱导步骤1)所培养的所述酿酒酵母工程菌；
[0019] 3)从步骤2)中被诱导的所述酿酒酵母工程菌培养物提取白桦脂酸。
[0020]优选地，步骤1)中使用加有葡萄糖的SD-Trp-液体培养基培养所述酿酒酵母工程 菌。
[0021]优选地，步骤2)中使用加有半乳糖的SD-Trp-液体培养基培养所述酿酒酵母工程 菌以诱导所述酿酒酵母工程菌产生白桦脂酸。
[0022]优选地，所述方法包括以下步骤：
[0023] 1)将所述酿酒酵母工程菌接种于加有2%葡萄糖的SD-Trp-液体培养基中，置于30 °C，250rpm/min培养 16小时；
[0024] 2)收集菌体，用无菌水洗涤，重悬于加有2%半乳糖的SD-Trp-培养基中至起始 OD60Q值为0.8，置于30 °C，250rpm/min下诱导培养7天；
[0025] 3)用2M HC1将步骤2)中得到的酵母培养物调至PH2.0，用等体积的乙酸乙酯抽提3 次，合并这3次的乙酸乙酯相，吹干；
[0026] 4)将步骤3)中吹干后用少量乙酸乙酯复溶，转入2ml离心管，吹干，即得到白桦脂 酸。
【附图说明】
[0027] 图 1为质粒 PESC-TRP-LUP-BPLO的图谱；
[0028] 图2为酵母整合YIPlac204-LUP-BPL0的图谱；
[0029 ]图3为PCR产物的电泳照片，其中泳道1和3分别是以酿酒酵母株系WAT 11 (泳道3)和 WAT 11 -LUP-BPL0 (泳道1)为模板，扩增LUP基因的PCR产物电泳照片，泳道2和4分别是以酿酒 酵母株系WAT 11 (泳道4)和WAT11-LUP-BPL0 (泳道2)为模板，扩增BPL0基因的PCR产物电泳照 片；
[0030] 图4为PCR产物的电泳照片，该PCR以酿酒酵母株系W80(泳道1)和WAT 11-LUP-BPL0 (泳道2)的基因组为模板，使用引物P7/P10进行；
[0031] 图5为酿酒酵母株系WAT11-LUP-BPL0所生产的白桦脂酸的质谱分析图，其中箭头 标出的峰为白桦脂酸。
[0032]图6为显示使用酿酒酵母株系W80和酿酒酵母株系WAT11-LUP-BPL0的白桦脂酸产 量的柱状图。
【具体实施方式】
[0033]以下结合实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明， 并非用于限定本发明的范围。
[0034]实施例1生产白桦脂酸的酿酒酵母株系WAT11-LUP-BPL0的构建
[0035] 1、酵母整合载体YIPlac204-LUP_BPL0的构建
[0036] 将拟南芥（Arab idops i s tha 1 iana )的LUP基因以及来自白桦木（Be tu 1 a platyphylla)的BPLO基因分别连接在同一 PESC-Trp载体的GAL1以及GAL10启动子下，得到 质粒PESC-TRP-LUP-BPLO(图1)。因酶切位点的需要，对LUP基因中的EcoRV酶切位点的一个 碱基进行点突变(将GATATC中的胞嘧啶突变为胸腺嘧啶）。具体方法如下：以质粒PESC-TRP-LUP-BPL0为模板，分别使用两对引物P1/P4和P2/P3进行第一轮PCR。然后将第一轮的两组 PCR的产物等量混合作为模板，用引物对P3/P4进行第二轮PCR。将第二轮产物进行琼脂糖凝 胶电泳回收目的条带大小的片段，连接至T载进行测序。将测序正确的克隆用PstI以及Xbal 酶切，将包含LUP基因表达盒和BPL0基因表达盒的片段连接至酵母整合载体YIplac204,得 到 YIPlac204-LUP-BPL0(图 2)。
[0037]所用引物序列分别为：
[0041 ] 2、YIplac204-LUP-BPL0 转化酿酒酵母 WAT11
[0042] 将YIplac204-LUP-BPL0用EcoRV线性化，经琼脂糖凝胶电泳回收后，用醋酸锂转化 法转化WAT 11菌株，通过SD-Trp-缺陷型平板筛选转化子，将平板置于30°C生长，将生长良好 的单克隆接入SD-Trp-缺陷型液体培养基进行扩大培养，提基因组DNA进行PCR鉴定阳性转 化子。所得的转化子即为能够生产白桦脂酸的酿酒酵母株系WAT11-LUP-BPL0。经PCR鉴定 (图3)，酿酒酵母株系WAT 11中没有LUP基因和BPLO基因，而本发明构建的酿酒酵母株系 WAT 11-LUP-BPLO中存在LUP基因和BPLO基因，这两个基因表达盒成功地整合至基因组中，并 随基因组的复制而复制。
[0043]实施例2高产白桦脂酸的酿酒酵母株系W80的构建
[0044]实施例1中构建的酿酒酵母株系WAT11-LUP-BPL0已经能够生产白桦脂酸，发明人 在此基础上继续研究，意外地发现当调控因子GAL 80基因发生突变后，产物白桦脂酸的含 量得到大大提高。根据该发现，发明人对酿酒酵母株系WAT11-LUP-BPL0进行了进一步的改 进，通过同源重组的方法敲除了酿酒酵母株系WAT11-LUP-BPL0基因组中的GAL 80基因。具 体方法如下：
[0045] 1.同源敲除片段的构建
[0046] 由口1166质粒化111'〇8〇3奸）为模板，使用引物？5/?6扩增1(??-1^11]\1?(-1(??筛选标记 片段（1724bp)，以酿酒酵母WAT11基因组DNA为模板，使用引物P7/P8扩增GAL80基因的5 '区 片段(393bp)，使用引物P9/P10扩增GAL80基因的3 '区片段(393bp)。
[0047]扩增用到的引物：
[0054] 50μ1 PCR反应体系为：10 X Buffer 5μ1，引物各lyl(lOpmol)，10mM dNTP ΙμL， cDNA模板ΙμL，DNA聚合酶0.5μ1，加入ddH20至终体积50μ1;反应条件为：95 °C预变性3min，95 。(:变性30s，55°C退火30s，72°C延伸2min，进行30个循环，最后72°C延伸lOmin。
[0055] 将以上得到的三个片段分别回收纯化，并将该三片段的混合物作为模板，使用引 物P5/P10进行扩增，得到由以5'至3'方向排列的GAL80基因的5'区片段+loxP-KanMX-loxP 的筛选标记片段+GAL80基因的3'区片段组成的GAL80基因敲除框。将GAL80基因敲除框插入 到载体PMD-19T的BamHI与EcoRI多克隆位点之间，用得到的质粒转化大肠杆菌E.coli DH5 α，挑取含该质粒的单克隆，进行测序。提取测序正确的质粒，用内切酶BamHI与EcoRI双酶 切，回收GAL80基因敲除框片段。
[0056] 2.GAL80基因的敲除
[0057]通过醋酸锂转化法，将以上得到的GAL80基因敲除框片段转化至实施例1得到的酿 酒酵母株系WAT11-LUP-BPL0中。使转化产物在包含200mg/L遗传霉素的SD-Trp-营养缺陷培 养基平板上于30°C下生长以筛选转化子，将生长良好的单克隆接种于含遗传霉素的液体培 养基进行扩大培养，提取基因组DNA进行PCR鉴定阳性转化子。通过醋酸锂转化法向阳性转 化子转入Cre重组酶，转化子中自动发生第二次同源重组，丢失loxP-KanMX-loxP表达框。将 发生二次同源重组的转化子接种于不含抗生素的YPDA培养基继代进行丢失Cre重组酶。将 丢失loxP-KanMX-loxP表达框和Cre重组酶的转化子提基因组DNA进行PCR鉴定。使用的鉴定 引物为P7和P10。
[0058] 经PCR鉴定（图4)，成功构建了正确缺失了 1308bp GAL80基因编码框的基因工程改 造菌株，命名为W80。
[0059] 实施例3使用本发明的酿酒酵母菌株生产和提取白桦脂酸
[0060] 1.白桦脂酸的生产和提取
[0061 ]将实施例1或2中得到的酿酒酵母株系WAT11-LUP-BPL0或W80接种于以2%葡萄糖 为碳源的SD-Trp-液体培养基中，置于30°C，250rpm/min培养16小时，然后收集菌体并且用 无菌水洗涤后重悬于以2%半乳糖为碳源的5〇-1'印-培养基中至起始0〇6〇()值为0.8，置于30 °C，250rpm/min进行诱导培养7天。将上述所得酵母培养液进行酸化(2M HC1调PH至2.0)，用 等体积的乙酸乙酯抽提3次。合并3次的乙酸乙酯相，吹干。吹干后用少量乙酸乙酯复溶，转 入2ml离心管，吹干。由此得到白桦脂酸 [0062] 2.白桦脂酸的鉴定和定量
[0063] 将以上得到的白桦脂酸用50μ1硅烷化试剂BSTFA进行衍生化，80 °C，放置30min。反 应过后待离心管冷却至室温，离心，吸上清层转入干净无水的内衬管，进行GC-MS检测。GC-MS检测采用安捷伦7890GC和5975C质谱检测器，以及毛细管色谱柱HP-5MS。载气为氦，流速 1.2ml/min，通过不分流模式进样ΙμL，温度为250 °C，升温程序为80 °C起始，以20 °C/min升至 310°C，保持15min。质谱条件：电离源EI，电子能量70eV，离子源温度为230°C，全扫描模式和 选择离子模式，全扫描模式扫描范围m/z为50-600 AC-MS检测结果证实这两个菌株能够生 产白桦脂酸（图5)，其产量如图6所示。结合图5和图6可看出，酿酒酵母株系WAT11-LUP-BPL0 和W80都能产生白桦脂酸，并且W80的白桦脂酸产量是前者的2-3倍。
[0064]以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和 原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述酿酒酵母工程菌为以酿酒酵母株系WATl 1为 基础，基因组中整合了 LUP基因表达框和BPLO基因表达框，其中所述LUP基因表达框由LUP基 因有效连接于第一可诱导启动子而形成，所述LUP基因的序列如SEQ ID NO: 1所示，所述 BPLO基因表达框由BPLO基因有效连接于第二可诱导启动子而形成，所述BPLO基因的序列如 SEQ ID NO:2所示。2. 根据权利要求1所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述第一可诱导启动子为GALl 启动子，序列如SEQ ID NO:3所示。3. 根据权利要求1所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述第二可诱导启动子为 GALlO启动子，序列如SEQ ID N0:4所示。4. 根据权利要求1所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述工程菌的GAL80基因被部 分或全部敲除，所述GAL80基因的序列如SEQ ID NO: 16所示。5. -种构建酿酒酵母工程菌的方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 将LUP基因顺着GALl启动子的方向插入到PESC-Trp载体的GALl启动子的下游，使所 述LUP基因处于所述GALl启动子的控制下，并且将BPLO基因顺着GALlO启动子的方向插入到 所述PESC-Trp载体的GALlO启动子的下游，使所述BPLO基因处于所述GALlO启动子的控制 下，从而得到集成了 LUP基因表达框和BPLO基因表达框的质粒PESC-TRP-LUP-BPLO，其中所 述LUP基因的序列如SEQ ID NO: 1所示，所述GALl启动子的序列如SEQ ID N0:3所示，所述 BPLO基因的序列如SEQ ID N0:2所示，所述GAL10启动子的序列如SEQ ID N0:4所示； 2) 通过定点突变的方法将所述质粒PESC-TRP-LUP-BPLO中所述LUP基因中GATATC中的 胞嘧啶突变为胸腺嘧啶； 3) 用EcoRV酶切步骤2)中得到的突变的质粒PESC-TRP-LUP-BPLO，使其线性化，然后将 所述线性化的质粒PESC-TRP-LUP-BPLO转入酿酒酵母WATl 1中，通过酵母菌体内自动发生的 同源重组使所述LUP基因表达框和所述BPLO基因表达框整合至所述酵母菌的基因组中。6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，还包括以下步骤： 4) 将由以5 '至3 '方向排列的GAL80基因5 '区序列+1 〇xP-KanMX-1 〇XP+GAL80基因3 '区序 列组成的GAL80基因敲除框转化至步骤3)中得到的基因组中整合了所述LUP基因表达框和 所述BPLO基因表达框的酿酒酵母中，通过细胞内自动发生的同源重组使所述酿酒酵母中的 GAL80基因的相应位置被所述GAL80基因敲除框替换，所述GAL80基因敲除框的序列如SEQ ID NO:5所示； 5) 将Cre重组酶转化至步骤4)得到的GAL80基因被敲除的酿酒酵母中，使所述GALSOS 因敲除框再次发生重组，丢失所述loxP-KanMX-loxP片段，从而得到具有所述LUP基因表达 框和所述BPLO基因表达框并且缺失了所述GAL80基因编码框的酿酒酵母工程菌。7. -种生产白桦脂酸的方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 培养权利要求1-4中任一项所述的酿酒酵母工程菌至对数期； 2) 诱导步骤1)所培养的所述酿酒酵母工程菌； 3) 从步骤2)中被诱导的所述酿酒酵母工程菌培养物提取白桦脂酸。8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤1)中使用加有葡萄糖的SD-Trp-液体 培养基培养所述酿酒酵母工程菌。9. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤2)中使用加有半乳糖的SD-Trp-液体 培养基培养所述酿酒酵母工程菌以诱导所述酿酒酵母工程菌产生白桦脂酸。10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 将所述酿酒酵母工程菌接种于加有2%葡萄糖的SD-Trp-液体培养基中，置于30°C， 250rpm/min培养至对数期； 2) 收集菌体，用无菌水洗涤，重悬于加有2 %半乳糖的SD-Trp-培养基中至起始OD600值 为0.8，置于30°C，250rpm/min下诱导培养； 3) 用2M HCl将步骤2)中得到的酵母培养物调至PH 2.0,用等体积的乙酸乙酯抽提3次， 合并这3次的乙酸乙酯相，吹干。
【文档编号】C12N15/81GK105886415SQ201610318425
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年5月13日
【发明人】陈国平, 陈斌, 章焰生, 周晨
【申请人】湖北仁悦药业股份有限公司, 中国科学院武汉植物园