一种产l-色氨酸基因工程菌及其构建方法与用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物领域，设及一种产k色氨酸基因工程菌及其构建方法与用途。
【背景技术】
[0002] 色氨酸，学名β-吗I噪基丙氨酸(β-indolylalanine)，是人体和动物生命活动中必 需的氨基酸之一，对人和动物的生长发育、新陈代谢起着重要的作用，被称为第二必需氨基 酸，广泛应用于医药、食品和饲料等方面。在医药领域，色氨酸是氨基酸输液的重要组分和 重要的医药中间体。在食品应用领域，色氨酸可用于强化食品，提高风味，也可用于面包促 进发酵。在饲料添加领域，当赖氨酸和蛋氨酸得W满足之后，色氨酸成为日粮重要限制性氨 基酸，补充外源色氨酸可W提高畜、禽、鱼类日粮内色氨酸的含量，改善日粮氨基酸组成和 比例，提高日粮蛋白质的价值和利用效率。
[0003] 目前心色氨酸的生产方法主要有四种，包括蛋白水解法、化学合成法、酶促转化法 和生物发酵法。蛋白水解法和化学合成法分别存在着原材料来源有限、生产工艺和步骤多、 光学拆分难且得率低、生产周期长等缺点，在工业生产中受到极大限制。酶促转化法具有终 产物积累量高、反应周期短、分离提纯容易等优点，是生产心色氨酸的有效方法，曾被世界 各国广泛用于k色氨酸的工业化生产。但酶促转化法生产k色氨酸的底物k丝氨酸和吗I噪 的价格昂贵，且吗I噪难溶于水，对色氨酸合成酶抑制强烈，影响转化率的提高，导致酶促转 化法生产心色氨酸的成本居高不下。故生物发酵法是目前广泛应用于工业生产心色氨酸的 主要方法。
[0004] 生物发酵法生产心色氨酸的研究始于二十世纪60年代初期，但在之后相当长的一 段时期内达不到工业化生产的要求，主要原因是从葡萄糖到レ色氨酸的生物合成途径漫 长，其代谢流也比较弱，且k色氨酸合成需要多种前体物(如k丝氨酸，谷氨酷胺，PRPP等）。 另一方面，k色氨酸生物合成途径中的代谢调控机制也比较复杂。
[000引 1979年，Tribe和Pittard利用DNA重组技术首次将trpE基因引入大肠杆菌 化scherichia。01;0，心色氨酸产量达到lg/L(T;ribe DE,Pittard J.Hype;rp;roduction of tryptophan by Escherichia coli:genetic manipulation of the pathways leading to tryptophan formation.Appl Environ Microbiol,1979,38(2):181-190.)。
[0006] 此后，随着基因重组技术在微生物育种中的广泛应用，色氨酸生产菌株的筛选 技术取得了重大突破，心色氨酸产酸水平也得到了巨大提高。
[0007] 1996年，BeriT在大肠杆菌中高表达去除反馈抑制（feed-back resistance，扎r) 的aroGfbT和化pEf叫)CBA基因，发酵52小时产レ色氨酸近45g/L，过程最高糖酸转化率约为 22%(Berry A.Improving production of aromatic compounds in Escherichia coli by metabolic engineering.Trends Biotechnol，1996，14(7):250-256.)。
[0008] 1999年，Ikeda等在产^色氨酸的谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum) ρΙΚ9960中高表达tktA基因，增加^色氨酸合成前体E4P的水平，从而提高^色氨酸的合成 效率，发酵80小时的心色氨酸产量达到58g/L(Ikeda M，Katsumata R.Hypei'production of tryptophan by Corynebacterium glutamicum with the modified pentose phosphate pathway.Appl Environ Microbiol,1999,65(6):2497-2502.)。
[0009] 另外，W重组大肠杆菌为宿主菌生产^色氨酸的授权专利还有W09408031A1、 6口0293207、1154371614、1]54588687、〔化289676(：、〔^00582220(：和〔化016223388等。运些专 利保护其新构建的位点，也描述了它们不同发酵产酸的能力。
[0010] 大肠杆菌可通过多种途径转运并憐酸化葡萄糖生成6-憐酸葡萄糖（图1 )，然后将 其导入糖酵解途径。
[0011] 野生型大肠杆菌利用憐酸締醇式丙酬酸-糖憐酸转移酶系统（简称PTS系统)转运 并憐酸化葡萄糖（图1) dPTS系统是憐酸締醇式丙酬酸-糖憐酸转移酶系统的简称，由EI、HPr 和EEs构成，其中EI和HPr分别由ptsi和ptsH基因编码，为胞质可溶性蛋白；EEs包括E Π Man、E Π Fru、E Π Bgl、E Π AGIc和E Π CBGIc等，多为蛋白复合体，对碳水化合物具有特异性，其中 ΕΠΑ"。和EnCB"。分别由err和ptsG基因编码。PTS系统在葡萄糖转运和憐酸化过程中起重 要作用，是大肠杆菌糖代谢基因表达调控的核屯、。PTS系统转运1摩尔葡萄糖需消耗1摩尔憐 酸締醇式丙酬酸（PEP) (Imol Glucose+lmol PEP一Imol Glucose-6-P+lmol Pyruvate) (Neidhardt FC,Postma PW,Lengeler JW,et al.Escherichia coli and Salmonella.2nd ed.Washington D.C.:ASM F*ress, 1996:1824-1866. ;Hern自ndez-Montalvo 化ez A, Hernandez-Chavez G，et al.Expression of galP and glk in a Escherichia coli PTS mutant restores glucose transport and increases glycolytic flux to fermentation products.Biotechnol Bioeng,2003,83(6) :687-694. )D当大肠杆菌在 1^葡 萄糖为碳源的限制性培养基中生长时，PTS系统消耗了约50%的PEP用于葡萄糖的转运和石葬 酸化，直接影响WPEP为前体的化合物(如莽草酸、芳香族氨基酸和天冬氨酸族氨基酸等）的 合成（Gosset G. Improvement of Escherichia coli production strains by modification of the phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase system.Microb Cell Fact ,2005,4(1):14. )D同样直接影响WPEP为前体的^色氨酸的合 成。
[0012] PTS系统缺陷型大肠杆菌可^通过半乳糖/氨离子协同转运蛋白（D-Galactose/化 symporter，GalP)和葡萄糖激酶(Glucokinase，G；Lk)协同作用转运葡萄糖入胞（图1)，WATP 为石葬酸基团供体（Imol Glucose+lmol ATP一Imol Glucose-6-P+lmol ADP)，但?GalP和 Glk协同作用5葬酸化转运葡萄糖的效率较化（Neidhardt FC，Postma PW，Lengeler JW，et al.Escherichia coli and Salmonella. 2nd ed.Washington D.C.:ASM Press,1996: 1824-1866. ;Hern自ndez-Montalvo V，Martinez A，HΘrn自ndΘz-ChavΘz G，et al.Expression of galP and glk in a Escherichia coli PTS mutant restores glucose transport and increases glycolytic flux to fermentation products .Biotechnol Bioeng,2003,83(6):687-694.；Gosset G. Improvement of Escherichia coli product ion strains by modification of the phosphoenolpyruvate: sugar phosphotransferase system.Microb Cell Fact,2005,4 (1):14.)〇
【发明内容】
[0013] 有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术存在的缺陷提供一种k色氨酸产量高 的基因工程菌及其构建方法与用途。
[0014] 为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
[0015] 本发明提供了一种产k色氨酸基因工程菌，其PTS系统中一个或多个基因被敲除 或失活，且一个或多个W非PEP为底物的葡萄糖转运蛋白或酶相关基因被过表