一种酪氨酸酚裂解酶工程菌及其构建方法与应用
【专利摘要】本发明涉及一种酪氨酸酚裂解酶工程菌及其构建方法与应用，将酪氨酸酚裂解酶基因构建表达质粒，同时导入伴侣蛋白表达质粒所得到，鉴定为大肠埃希氏菌，命名为大肠埃希氏菌 FPLF8（Escherichia coli HPLF8），保存于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2016年2月19日，保藏编号为CCTCCNO：M 2016065。利用该工程菌，可以通过发酵、转化合成左旋多巴，表达高效，表达产物稳定、活性高，可以在提供相关底物下，转化合成左旋多巴，工艺简单，成本低廉，产率高，同时三废排放少，具有工业化生产的应用价值。CCTCC NO: M201606520160219
【专利说明】
一种酪氨酸酚裂解酶工程菌及其构建方法与应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种工程菌及其构建方法，具体是一种酪氨酸酚裂解酶工程菌及其构 建方法与应用，属于基因工程领域。
【背景技术】
[0002] 左旋多巴（3，4-dihydroxyphenyl-L-ananine，简称L-D0PA)的化学名称为3，4_二 羟基苯基丙氨酸，其结构式为：
作为一种重要的生物活性物质，L-D0PA是从L-酪氨酸到儿茶酚或黑色素的生化代谢途 径过程中的重要中间产物。
[0003] 上世纪60年代，国外许多学者开始致力于微生物酶法合成L-D0PA的研究。为了提 高L-D0PA产量和底物转化率，研究者们对微生物酶法合成L-D0PA的工艺方法进行了大量研 究。
[0004] 酪氨酸酸裂解酶（Tyrosine phenol lyase，TPL，E.C.4.1.99.2)，又名β-酪氨酸 酶，以磷酸吡咳醛(pyridoxal_phosphate，PLP)为辅酶，以钾离子和氨离子为辅助因子，TPL 可以催化L-酪氨酸发生β-消去反应生成苯酚、丙酮酸和氨。由于这个反应是可逆的，将邻苯 二酚代替苯酚后，可由邻苯二酚、丙酮酸和氨可在TPL催化下生成L-D0PA。左旋多巴的前体 在较高浓度时对酶活都有抑制作用，其中邻苯二酚及丙酮酸除了有强抑制作用外，还会导 致酶的不可逆失活，反应条件难以控制，副产物多，L-D0PA的产率低。
[0005] 也有一些利用自然界中的细菌，如i?scAericAia、Pro ieus(变形菌属）、 ?SYizoJoWufflAassjbo和i?rri/3ia(欧文氏菌属)等，来合成L-D0PA，如左旋多巴酶法合成综述 报道，TPL大肠杆菌基因工程菌转化30h，转化生成29.6g/L的L-D0PA。又如，Jang-Young Lee 等人克隆来源于Escherichia coli W(ATCC11105)的对羟基苯乙酸-3-羟基化酶（口-hydroxyphenylacetate 3-hydroxylase，PHAH)，转化L-酪氨酸为L-D0PA，产物累积至 10g/ L，该技术申请了专利US5837504。研究者发现这些重组菌株虽然TPL的表达量高于野生菌 株，但最终的L-D0PA合成能力却没有明显提高甚至低于野生菌株。这可能因为要获得较高 的L-D0PA合成能力，菌株除了具备TPL高活性外，还要有相对完善的底物、产物出入细胞膜 的转运机制以及对底物邻苯二酚抑制酶活的耐受力等。总体来说，反应条件难以控制，稳定 性差，副产物多，L-D0PA的产率低。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的之一是提供一种工程菌；鉴定为大肠埃希氏菌，命名为大肠埃希氏 菌FPLF8(Escherichia coli FPLF8)，保存于中国典型培养物保藏中心，保藏地址:武汉大 学武昌珞珈山，保藏日期为2016年2月19日，保藏编号为CCTCCNO:M 2016065。
[0007] 本发明的目的之一是提供所述工程菌的构建方法，将酪氨酸酚裂解酶基因构建表 达质粒，同时导入伴侣蛋白表达质粒，得到大肠埃希氏菌FPLF8。
[0008] 本发明的目的之三是提供所述工程菌的应用，利用该工程菌，可以通过发酵、转化 合成左旋多巴，产率高、副产物少，稳定性好，品质好，三废排放少。
[0009] 为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案： 所述工程菌是将酪氨酸酚裂解酶基因连入表达载体上，构建表达质粒PFPL，再将表达 质粒pFPL导入受体菌大肠杆菌中得到。
[0010]作为优选，向导入有表达质粒PFPL的大肠杆菌中再导入伴侣蛋白表达质粒，获得 大肠埃希氏菌FPLF8。导入伴侣蛋白表达质粒，可以起到促进大肠埃希氏菌FPLF8酶的可 溶性表达，从而提高单位菌体的酶活，和发酵酶活性单位的稳定，后续转化合成左旋多巴 时，投菌量少，反应快速，保持高产率，后续转化合成左旋多巴稳定。
[0011]进一步，所述伴侣蛋白表达质粒为PG-KJE8,效果更明显，大肠埃希氏菌FPLF8目 的酶表达更佳。
[0012] 作为优选，所述酪氨酸酚裂解酶基因来源于弗氏柠檬酸杆菌，连入表达载体上融 合性好，后续表达稳定，表达产物更高效地、更专一的合成左旋多巴，副产物少，给后续的分 离纯化带来了很大的方便，并简化了分离步骤，有效的降低了生产成本。
[0013] 作为优选，所述表达载体采用pET24a，与目的基因片段融合性更好，后续表达更稳 定。
[0014] 作为优选，所述受体菌大肠杆菌采用BL21 (DE3)，酶表达效率高，而且表达稳定，产 率高，遗传稳定性高。
[0015] 作为优选，构建方法具体包括:（1)将克隆得到的酪氨酸酚裂解酶全基因片段整合 进表达载体pET24a上，并将整合后的重整质粒转化进入BL21 (DE3 )，获得FPL菌；（2 )将伴侣 蛋白表达质粒导入FPL菌中，获得FPLF8菌。
[0016]上述方案通过优选表达载体和受体菌，可以有效提尚目的基因片段的表达效率， 表达稳定性，借助伴侣蛋白表达质粒，提高工程菌表达产生酪氨酸酚裂解酶活性以及稳定 性。
[0017]上述所得到的工程菌大肠埃希氏菌FPLF8,用于在底物溶液存在条件下，转化产 生L-多巴。
[0018]具体操作步骤包括： (1) 挑单菌落接种到含LB培养基的试管中，加卡纳霉素（100mg/L)、氯霉素(25mg/L)， 35-37°C，220rpm，培养 12-16h，得到一级种子； (2) 将所述一级种子接种到含发酵培养基的摇瓶中，35-37°C，200-250rpm，培养2-5h， 加 IPTG至终浓度1-1.5mM，23-27°C，180-220rpm，培养10-12h;所述发酵培养基组分如下:胰 蛋白胨128/1、酵母提取物248/1、甘油58/1，磷酸二氢钾2.318/1、三水磷酸氢二钾16.43 g/L； (3) 离心收菌，得到菌体； (4) 菌体60g，加入底物溶液，搅匀，25°C，密封震荡反应;所述底物溶液包括14-16g/L的 丙酮酸钠、l〇_12g/L的邻苯二酚、40-45g/L的氯化铵、2-5 g//L的亚硫酸钠、l_3g/L的EDTA，调 pH7.5-8.5； 作为优选，步骤(4)中反应期间，多次添加底物邻苯二酚和丙酮酸钠，控制邻苯二酚浓 度不超过l〇g/L。
[0019] 本发明的有益效果如下:本发明得到工程菌，表达高效，表达产物稳定、活性高，可 以在提供相关底物下，转化合成左旋多巴，工艺简单，成本低廉，产率高，同时三废排放少， 具有工业化生产的应用价值。
【具体实施方式】
[0020] 下面结合实施例对本发明进一步加以说明。
[0021] 实施例1: 1.将BL2UDE3)制备成感受态细胞 使用TAKARA感受态细胞制备试剂盒，按说明书操作，制备获得BL21 (DE3)感受态。
[0022] 2.全基因合成酪氨酸酚裂解酶基因片段 根据Gene ID:X66978.1提供的序列，合成来源的酪氨酸酚裂解酶全基因片段。
[0023] 3.构建酪氨酸酶表达质粒pFPL 将酪氨酸酶全基因片段亚克隆至pET24a质粒，酶切位点BamHI，Xhol。
[0024] 4.表达质粒pFPL导入感受态细胞 1) 感受态从-70度取出后立刻插入冰水浴中3min; 2) 超净台中取1微升的质粒pFPL加入感受态，轻弹混匀，立刻插入冰水浴25min，静置； 3) 将感受态轻轻转移至42度水浴热激1.5min，立刻轻轻转移至冰水浴5min; 4) 加700微升左右的LB，150rpm，37度，60min复苏； 5 )3500rpm*3min，弃上清600-700微升，剩余菌液吹吸混匀，涂布加氨苄青霉素（100mg/ L)LB平板，37°C培养16h，获得大肠埃希氏菌FPLF8。
[0025] 实施例2: 1.将BL2UDE3)制备成感受态细胞 使用TAKARA感受态细胞制备试剂盒，按说明书操作，制备获得BL21 (DE3)感受态。 [0026] 2.全基因合成酪氨酸酚裂解酶基因片段 根据Gene ID:X66978.1提供的序列，合成来源的酪氨酸酚裂解酶全基因片段。
[0027] 3.构建酪氨酸酶表达质粒pFPL 将酪氨酸酶全基因片段亚克隆至pET24a质粒，酶切位点BamHI、Xh〇I。
[0028] 4.表达质粒pFPL导入感受态细胞 6) 感受态从-70度取出后立刻插入冰水浴中3min; 7) 超净台中取1微升的质粒pFPL加入感受态，轻弹混匀，立刻插入冰水浴25min，静置； 8) 将感受态轻轻转移至42度水浴热激1.5min，立刻轻轻转移至冰水浴5min; 9) 加700微升左右的LB，150rpm，37度，60min复苏； 10) 3500rpm*3min，弃上清600-700微升，剩余菌液吹吸混匀，涂布加氨苄青霉素 (100mg/L)LB 平板，37°C 培养 16h，获得 FPL 菌； 5. FPL菌感受态制备 使用TAKARA感受态细胞制备试剂盒，按说明书操作，制备获得BL21 (DE3)感受态。
[0029] 6.伴侣蛋白表达质粒导入FPL感受态细胞 1) 感受态从-70度取出后立刻插入冰水浴中3min; 2) 超净台中取1微升的伴侣蛋白表达质粒PG-KJE8加入感受态，轻弹混匀，立刻插入冰 水浴25min，静置； 3) 将感受态轻轻转移至42度水浴热激1.5min，立刻轻轻转移至冰水浴5min; 4) 加700微升左右的LB，150rpm，37度，60min复苏； 5 )3500rpm*3min，弃上清600-700微升，剩余菌液吹吸混勾，涂布加卡纳霉素（100mg/ L)、氯霉素(25mg/L)LB平板，37 °C培养16h，获得FPLF8菌。
[0030] 实施例3: 与实施例2的不同之处在于，伴侣蛋白表达质粒选用pKJE7。
[0031] 实施例4: 1.将BL2UDE3)制备成感受态细胞 使用TAKARA感受态细胞制备试剂盒，按说明书操作，制备获得BL21 (DE3)感受态。
[0032] 2.全基因合成酪氨酸酚裂解酶基因片段 根据Gene ID:X66978.1提供的序列，合成来源的酪氨酸酚裂解酶全基因片段。
[0033] 3.构建酪氨酸酶表达质粒pFPL 将酪氨酸酶全基因片段亚克隆至pET24a质粒，酶切位点BamHI，Xhol。
[0034] 4.表达质粒pFPL导入感受态细胞 11) 感受态从-70度取出后立刻插入冰水浴中3min; 12) 超净台中取1微升的质粒pFPL加入感受态，轻弹混勾，立刻插入冰水浴25min，静 置； 13) 将感受态轻轻转移至42度水浴热激1.5min，立刻轻轻转移至冰水浴5min; 14) 加700微升左右的LB，150rpm，37度，60min复苏； 15) 3500rpm*3min，弃上清600-700微升，剩余菌液吹吸混匀，涂布加氨苄青霉素 (100mg/L)LB 平板，37°C 培养 16h，获得 FPL 菌； 5. FPL菌感受态制备 使用TAKARA感受态细胞制备试剂盒，按说明书操作，制备获得BL21 (DE3)感受态。 [0035] 6.伴侣蛋白质粒导入FPL感受态细胞 6) 感受态从-70度取出后立刻插入冰水浴中3min; 7) 超净台中取1微升的伴侣蛋白表达质粒PG-KJE8加入感受态，轻弹混匀，立刻插入冰 水浴25min，静置； 8) 将感受态轻轻转移至42度水浴热激1.5min，立刻轻轻转移至冰水浴5min; 9) 加700微升左右的LB，150rpm，37度，60min复苏； 10) 3500rpm*3min，弃上清600-700微升，剩余菌液吹吸混匀，涂布加卡纳霉素（100mg/ L)、氯霉素(25mg/L)LB平板，37 °C培养16h，获得FPLF8菌； 7.发酵产生酪氨酸酚裂解酶 LB培养基:胰蛋白胨10g/L、酵母提取物0.5 g/L、氯化钠10g/L、纯水。
[0036]发酵培养基:胰蛋白胨12g/L、酵母提取物24g/L、甘油5g/L，磷酸二氢钾2.31 g/L、 三水磷酸氢二钾16.43 g/L、纯水。
[0037] 1)挑单菌落接种4ml LB培养基试管中，加卡纳霉素（100mg/L)、氯霉素（25mg/L)， 37°C，220rpm，培养12h，得到一级种子； 2) -级种子接种到100ml的发酵培养基的摇瓶中，37 °C，220rpm，培养4h，加 IPTG至终浓 度lmM，25°C，220rpm，培养 12h; 3) 步骤(2 )中菌液离心收菌体，放置-20 °C冰箱。
[0038] 8.酪氨酸酚裂解酶转化产生L-多巴 1) 1L底物溶液：14g/L的丙酮酸钠、10g/L的邻苯二酚、40g/L的氯化铵、2g/l的亚硫酸 钠、lg/L 的 EDTA，调 PH8.0; 2) 菌体60g，加入1L底物溶液，搅匀，25 °C，密封震荡反应； 3) 当邻苯二酚残留浓度至lg/L以下，停止反应，L-多巴浓度累积至85g/L以上。
[0039] 实施例5: 与实施例4的不同之处在于： 1.发酵产生酪氨酸酚裂解酶 4) 挑单菌落接种4ml LB试管，加卡纳霉素（100mg/L)、氯霉素（25mg/L)，35°C，200rpm， 培养14h，得到一级种子； 5) -级试管种子接种100ml的TB摇瓶，35 °C，200rpm，培养2h，加 IPTG至终浓度1.5mM，23 °C，180rpm，培养10h;发酵培养基:胰蛋白胨12g/L、酵母提取物24g/L、甘油5g/L，磷酸二氢 钾2.31 g/L、三水磷酸氢二钾16.43 g/L。
[0040] 6)离心收菌，放置-20 °C冰箱。
[00411 2.酪氨酸酚裂解酶转化产生L-多巴 4) 1L底物溶液：15g/L的丙酮酸钠、llg/L的邻苯二酚、43g/L的氯化铵、3g//L的亚硫酸 钠、2g/L 的 EDTA，调 PH7.5; 5) 菌体60g，PLP-100mg，加入1L底物溶液，搅匀，25 °C，密封震荡反应； 6) 转化过程补加底物邻苯二酚和丙酮酸钠，保持邻苯二酚浓度8g/L; 7) L-多巴累积至65g/L，停止增加底物，当邻苯二酚残留浓度至lg/L以下，停止反应，L-多巴浓度累积至85g/L以上。
[0042] 实施例6: 与实施例4的不同之处在于： 在底物溶液存在条件下，发酵、转化产生L-多巴的具体操作步骤包括： (1) 挑单菌落接种到含LB培养基的试管中，加卡纳霉素（100mg/L)、氯霉素(25mg/L)， 36°C，250rpm，培养16h，得到一级种子； (2) 将所述一级种子接种到含发酵培养基的摇瓶中，36°C，250rpm，培养2-5h，加 IPTG至 终浓度ImM，27°C，220rpm，培养1 lh;所述发酵培养基组分如下:胰蛋白胨12g/L、酵母提取物 24g/L、甘油5g/L，磷酸二氢钾2.31 g/L、三水磷酸氢二钾16.43 g/L; (3) 步骤(2)中菌液离心收集菌体； (4) 菌体60g，加入底物溶液，搅匀，25°C，密封震荡反应;所述底物溶液包括16g/L的丙 酮酸钠、12g/L的邻苯二酚、45g/L的氯化铵、5g/L的亚硫酸钠、3g/L的EDTA，调pH8.5; (5 )当邻苯二酚残留浓度至0.5g/L以下，停止反应。
【主权项】
1. 一种酪氨酸酚裂解酶工程菌，名称为大肠埃希氏菌FPLF8(ESCheriChia coli FPLF8)，保存于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2016年2月19日，保藏编号为 CCTCCN0：M 2016065〇2. 根据权利要求1所述一种酪氨酸酚裂解酶工程菌，其特征在于，所述工程菌是将酪氨 酸酚裂解酶基因连入表达载体上，构建表达质粒PFPL，再将表达质粒pFPL导入受体菌大肠 杆菌中得到。3. 根据权利要求2所述一种酪氨酸酚裂解酶工程菌，其特征在于，向导入有表达质粒 PFPL的大肠杆菌中再导入伴侣蛋白表达质粒，获得大肠埃希氏菌FPLF8。4. 根据权利要求3所述一种酪氨酸酚裂解酶工程菌的构建方法，其特征在于，所述伴侣 蛋白表达质粒为PG-KJE8。5. 根据权利要求1所述一种酪氨酸酚裂解酶工程菌，其特征在于，所述酪氨酸酚裂解酶 基因来源于弗氏柠檬酸杆菌。6. 根据权利要求1所述一种酪氨酸酚裂解酶工程菌，其特征在于，所述表达载体采用 pET24a〇7. 根据权利要求1所述一种酪氨酸酚裂解酶工程菌，其特征在于，所述受体菌大肠杆菌 采用 BL2UDE3)。8. 如权利要求1所述一种酪氨酸酚裂解酶工程菌的构建方法，其特征在于，包括：（1)将 克隆得到的酪氨酸酚裂解酶全基因片段整合进表达载体pET24a上，并将整合后的重整质粒 转化进入BL21 (DE3)，获得FPL菌；（2)将伴侣蛋白表达质粒导入FPL菌中，获得FPLF8菌。9. 如权利要求1所述一种酪氨酸酚裂解酶工程菌的应用，其特征在于，用于在底物溶液 存在条件下，发酵、转化产生L-多巴。10. 根据权利要求9所述一种酪氨酸酚裂解酶工程菌的应用，其特征在于，在底物溶液 存在条件下，发酵、转化产生L-多巴的具体操作步骤包括： (1) 挑单菌落接种到含LB培养基的试管中，加卡纳霉素（100mg/L)、氯霉素（25mg/L)， 35-37°C，200-250rpm，培养 12-16h，得到一级种子； (2) 将所述一级种子接种到含发酵培养基的摇瓶中，35-37°C，200-250rpm，培养2-5h， 加 IPTG 至终浓度 1-1.5111]\1，23-27°(：，180-220印111，培养10-1211; (3) 步骤(2)中菌液离心收集菌体； (4) 菌体60g，加入底物溶液，搅匀，25°C，密封震荡反应;所述底物溶液包括14-16g/L的 丙酮酸钠、l〇_12g/L的邻苯二酚、40-45g/L的氯化铵、2-5 g//L的亚硫酸钠、l_3g/L的EDTA，调 pH7.5-8.5； (5) 当邻苯二酚残留浓度至lg/L以下，停止反应。
【文档编号】C12N15/70GK105886450SQ201610287965
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年5月4日
【发明人】储消和, 吴黎诚, 余炜, 方明山, 徐顺清, 周卫国, 张拥军
【申请人】浙江绿创生物科技有限公司, 浙江野风药业股份有限公司