一种辣椒疫霉游动孢子的单孢分离方法
【专利摘要】本发明涉及一种辣椒疫霉游动孢子的单孢分离方法。该方法是将辣椒疫霉接种V8培养基上，用封口膜密封25℃恒温培养5d后去掉封口膜照光24h后加入无菌水4℃诱导和常温释放各25min获得游动孢子悬浮液，稀释至每个(10×)视野中1?2个，取1mL加入带有抗生素的V8培养基平板中涂均匀，常温放置6h，通过倒置显微镜寻找单个萌发的游动孢子，用手术刀切0.5cm的正方形印痕，确认单孢后转移至抗生素平板中，纯化即为单孢株。本发明操作简便、准确性高、快速、分离效果好、设备简单，可短时间内大批量分离辣椒疫霉游动孢子的单孢子。
【专利说明】
一种辣椒疫霉游动孢子的单孢分离方法
技术领域
[0001] 本发明涉及农业植物保护技术领域，具体涉及一种辣椒疫霉游动孢子的单孢分离 方法。
【背景技术】
[0002] 辣椒疫病(Phytophthora blight)是由辣椒疫霉(Phytophthora capsici L.)引 起的一种毁灭性病害，除危害辣椒的根、莖、枝、叶和果实外，还危害番前、前子、黄瓜、甜瓜 等作物，常引起大面积死株，一般田块死株率为20 %-30 %，严重的达90 %以上，辣椒疫病对 产量、品质影响极大，严重时减产50%以上，甚至造成毁灭性的危害。辣椒抗病育种是防治 辣椒疫病的最直接、最有效的途径。开展了大规模的辣椒抗疫霉种质资源的筛选是抗病育 种的前提，而抗源筛选的前提是得到大量的且有代表性的单孢株。
[0003] 目前，辣椒疫霉游动孢子单孢株分离的方法基本是参考袁军海和姚裕琪(2002)对 马铃薯晚疫病菌游动孢子单孢子的分离方法:制备游动孢子囊或游动孢子悬浮液，待游动 孢子萌发产生芽管后在显微镜下进行，在载物台上将盖玻片消毒后置于消毒过载玻片上， 取10-15yL孢子悬浮液，在盖玻片上滴一滴，然后镜检，确认这滴悬浮液中只有1个游动孢子 囊或游动孢子，即为单孢株，该方法过程复杂，不容易找到单孢株，容易感染杂菌;朱桂宁等 (2003)采用稀释法对致病疫霉游动孢子单孢子进行分离，主要是稀释致一定浓度，涂抹到 黑麦和燕麦基础培养基上，一定时间后查看单菌落，确认单孢株，该方法也可能分离到菌丝 形成的菌落，且一旦菌落形成不容易确定是否为单孢子形成的菌落;辣椒疫霉单孢子囊分 离的方法基本采用柴贵贤等(2010)，主要是针对辣椒疫霉游动孢子囊的单囊分离。
[0004] 上述的研究报道的方法存在工作量大、准确性不足、耗费时间长、过程繁锁等问 题。针对辣椒疫霉游动孢子的单孢子分离、其个体小、颜色浅、在视野中无规则运动、其分离 难度大，本发明可操作性强、准确性高、速度快、分离效果好，设备简单。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是提供一种辣椒疫霉游动孢子的单孢子分离方法。
[0006] 为达到上述目的，本发明是通过以下技术方案得以实现。
[0007] (1)V8汁琼脂培养基的制备:将V8汁（100%蔬菜）（金宝V8,美国进口，超市有售）用 离心机4,000rpm离心去掉沉淀，配制10%的V8汁琼脂培养基，湿热灭菌20min;
[0008] (2)辣椒疫霉游动孢子囊的产生:将辣椒疫霉接种步骤（1)中制备的V8汁琼脂培养 基平板中，用封口膜(型号PM-996，美国Paraf ilm)密封，25°C黑暗培养5d促使菌丝生长，然 后去掉封口膜，转移至光下(5 0001x)23-25°C培养24h，促进游动孢子囊的产生；
[0009 ] (3)辣椒疫霉游动孢子悬浮液的配制:将步骤(2)产生大量的游动孢子囊的平板加 入15mL无菌水置于4°C冰箱中25min后，置于室温(23-25°C)25min，倒出悬浮液（即辣椒疫霉 游动孢子悬浮液），用无菌水稀释至平均在显微镜下每个(10 X )视野中只有1-2个游动孢子 的悬浮液；
[0010] (4)辣椒疫霉游动孢子平板的制备:取步骤(3)中lmL孢子悬浮液平铺于带有V8汁 琼脂培养基的平板上，放置室温(23-25 °C) 6h，促进游动孢子萌发；
[0011] (5)辣椒疫霉游动孢子单孢株的分离:将倒置显微镜放在无菌操作台上，30min紫 外灭菌后，将步骤(4)带有游动孢子的平板倒掉残余的悬浮液，放在载物台上在（10X)视野 中查找只有1个萌发的游动孢子，然后将手术刀在火焰上灭菌冷却后，在单个游动孢子周围 (倒置显微镜镜头正上方)培养基上切个长0.5cm的正方形切痕，再一次确认切痕中只有1个 游动孢子；
[0012] (6)辣椒疫霉游动孢子单孢株的挑取及纯化:用手术刀取出步骤(5)确认为带有单 个游动孢子的培养基小块后，放入另一个带有青霉素(50yg/mL)的V8培养基平板中，然后放 入恒温箱中25°C黑暗培养2d，挑取边缘的菌丝纯化到试管中，即得到辣椒疫霉游动孢子单 孢株。
[0013]本发明的显著优点：
[0014] 本发明是针对辣椒疫霉游动孢子小，无色，在视野中无规则游动难捕捉、不容易分 离，提供了一种辣椒疫霉游动单孢株分离的方法。辣椒疫霉孢子囊的产生传统方法有发明 专利公开号为CN102391980A和CN102391980A是诱导辣椒疫霉菌产生游动孢子的方法，这两 个专利获得游动孢子需要时间长，刷洗游动孢子或是用无菌型玻棒涂抹长满菌丝的培养基 平板，将会带有较多菌丝在里面，无法过滤出去，获得单游动孢子的机率降低，而本专利在 游动孢子释放过程中，对菌丝是没有任何扰动的，游动孢子悬浮液中是没有菌丝的，更适合 游动孢子单孢子分离的。专利公开号为CN102154193A也诱导辣椒疫霉菌产生大量孢子囊的 方法，但产生的孢子囊不能达到无菌条件，不能用于游动孢子单孢株的分离。本发明与其它 单孢分离方法相比，可操作性强、准确性高、速度快、分离效果好、设备简单，可以短时间在 实验室内进行大批量辣椒疫霉游动孢子的单孢株分离。
【具体实施方式】
[0015] 以下结合实施例和试验数据，对本发明上述的和另外的技术特征和优点作更详细 的说明。
[0016] 辣椒疫霉游动孢子的单孢株分离具体操作
[0017] 本实施例用辣椒疫霉(可自行分离培养，也可以相关报道中获得:司美茹，薛泉宏， 余博，袁虎林，陈占全.辣椒疫霉生防菌的双重筛选.植物保护学报，2006，33(1): 41-46;陈 孝仁，李艳朋，邢玉平，徐敬友，童蕴慧.辣椒疫霉CRN编码基因的克隆、转录特征及在与寄主 互作中的作用.植物病理学报，2015,45(4):384-394);金宝V8(100%蔬菜)汁为美国进口， 中国各大超市均有售;封口膜(型号PM-996,美国Parafilm)在试剂公司有售，具体操作如 下：
[0018] (1)辣椒疫霉游动孢子母液的获得
[0019]将要分离的辣椒疫霉接种到V8 (100 %蔬菜)汁培养基平板上，用封口膜密封，25 °C 黑暗培养5d促使菌丝生长，然后去掉封口膜，转移至光下（5 0001x)23°C培养24h促进游动 孢子囊的产生。在平板中加入15mL无菌水置于4°C冰箱中25min后，置于室温(23-25°C )20-30min，倒出悬浮液(即辣椒疫霉游动孢子悬浮液）。
[0020] (2)分生孢子的萌发和稀释
[0021]用无菌水稀释至显微镜每个(10 X)视野中仅含有1-2个游动孢子的悬浮液，取lmL 孢子悬浮液平铺于带有V8汁培养基的平板上，室温(23-25°C)放置6h，倒掉残余的悬浮液。 [0022] (3)分生孢子的单孢分离
[0023]将其放置在倒置显微镜上，在每个（10X)视野中观察只有1个萌发的游动孢子，用 手术刀在火焰上灭菌冷却后，在游动孢子周围（即倒置显微镜镜头上方）用刀切成长为 0.5cm的正方形小块，再一次确认其中只有1个萌发的孢子。用手术刀取出确认为带有单个 游动孢子的培养基小块后，放入另一个带有青霉素(50yg/mL)的V8培养基平板中，然后放入 恒温箱中25°C黑暗培养3d，挑取边缘的菌丝纯化到试管中，即得到辣椒疫霉游动孢子单孢 株。
[0024]实施例1、辣椒疫霉单孢株的交配型的测定
[0025]本实施例所用的辣椒疫霉对照菌株A1交配型(付迎坤，田晓丽，李屹，李莉.青海省 辣椒疫霉菌交配型分析及分布特征.北方园艺，2014( 18):
[0026]实验方法如下：
[0027] (1)辣椒疫霉的分离
[0028]在辣椒种植的地块采集辣椒疫霉病株，取病健交界处组织若干块，经70 %酒精处 理l-2s，然后放置到0.1%的升汞中处理3!^11，无菌水换洗3次，干燥后放入带有青霉素(5(^ g/mL)的V8汁琼脂培养基平板上，26 °C黑暗培养2-3d，待长出菌落，纯化备用。
[0029] (2)游动孢子单孢子分离
[0030] 游动孢子单孢株分离具体操作见上述"辣椒疫霉游动孢子的单孢子分离具体操 作"，共获得72个辣椒疫霉游动孢子单孢株。
[0031] (3)辣椒疫霉交配型的测定
[0032]将72个辣椒疫霉游动孢子单孢株和辣椒疫霉A1交配型利用V8汁培养基扩繁后，利 用打孔器打取0.7cm的菌蝶，然后分别将不同的辣椒疫霉游动单孢株分别与A1交配型的菌 蝶转移至新的V8汁培养平板(直径9cm)中，两菌蝶相距3復，26°(：黑暗对峙培养4(1后，通过倒 置显微镜如果观察到卵孢子，待测菌株为A2交配型，如果没有发现卵孢子则为A1交配型。结 果见表1。
[0033]表1 72个辣椒疫霉单孢株交配型的测定
[0034]
[0035] 从表1中可以看出，该地块辣椒疫霉两个交配型都有，其中A1交配型有39个，A2交 配型有33个，A1交配型略占优势。
[0036] 实施例2、辣椒品种对辣椒疫霉抗病性的测定
[0037] (1)黄瓜种植
[0038] 20个供试黄瓜品种，每品种种植20粒，每个培养钵(直径8cm) 1粒种子，其中5粒为 空白对照，培养基质为黑壤土，放置于温室中（13-33Γ)，每天浇水1次，15d后进行接种。 [0039] (2)供试菌株的扩繁
[0040]选择6个辣椒疫霉游动孢子的单孢株(单孢株的获得见"辣椒疫霉游动孢子的单孢 子分离具体操作"）分别接种到V8(100%蔬菜)汁培养基平板接种辣椒疫霉，用封口膜密封， 25°C黑暗培养5d促使菌丝生长，然后转移至光下（5 OOOlx)去掉封口膜23°C培养24h促进游 动孢子囊的产生，然后在平板中加入15mL无菌水置于4°C冰箱中25min后，置于室温(20-23 °C) 20-30min，倒出悬浮液(即辣椒疫霉游动孢子悬浮液）
[0041] (3)孢子悬浮液的配制及接种
[0042]利用血球计数板分别将6个辣椒疫霉游动孢子悬浮液配制成104个孢子/mL，然后 等量混合后，每个植株接种3mL囷悬液，每品种接15株，对照5株不接种，每隔1周调查1次。 [0043] (4)病害调查
[0044] 辣椒疫霉侵染黄瓜后，调查分级标准为：
[0045] 0 =无症状，1 =在茎基部有小的棕色或水浸状病变，2 =在茎基部有较大的棕色或 是水浸状病变，3 =植物茎基部完全水浸状，并溢缩，植物部分倒塌，叶子明显萎蔫，4 =植物 茎基部完全溢缩、植株倒塌严重萎蔫，5 =植株死亡。
[0048]其中，n =总调查次数，Xi =第i次调查的严重度，Ti为第i次调查的时间 [0049] (5)结果分析
[0050]通过对20个黄瓜品种抗辣椒疫霉抗性分析，结果见表1。
[00511表1 20个辣椒品种对6个辣椒疫霉单孢株混合抗病性的测定
[0054] 从表1可以看出，多数品种抗病性表现不好，高度感病，而来自美国的PI 561145和 Ames 28956抗病性表现较好，值得下一步深入研究其抗病机制。
[0055]总之，本发明针对辣椒疫霉游动孢子小且无规则运动、无色，单孢分离难度大，发 明了本方法，其可操作性强、准确性高、速度快、分离效果好，设备简单。本发明的方法简便 易行，可以短时间在实验室内进行大批量辣椒疫霉游动孢子的单孢子分离，然后进行交配 型、致病力测定和抗性资源的筛选等。
【主权项】
1. 一种辣椒疫霉游动孢子的单孢分离方法。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法是将V8汁用离心机4000rpm离心 去掉沉淀，配制10%的V8汁琼脂培养基，湿热灭菌后备用。3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于:所述方法是将辣椒疫霉接种到V8汁琼脂培 养基平板上，用封口膜密封，25°C黑暗培养5d促使菌丝生长，然后去掉封口膜转移至荧光灯 下(5 000 lx)23-25°C培养24h促进游动孢子囊的产生。4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于:所述方法是将产生大量的游动孢子囊的平 板加入15mL无菌水置于4°C冰箱中25min后，置于室温(23_25°C )25min，倒出悬浮液，即为辣 椒疫霉游动孢子悬浮液。5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于:所述方法中用无菌水稀释至平均每个（10 X )视野中只有1个游动孢子的悬浮液，将取ImL孢子悬浮液平铺于带有V8汁培养基的平板 上，室温（23-25°〇放置611。6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于:所述方法中将倒置显微镜放在无菌操作台 上，30min紫外灭菌后，将已经放置6h带有游动孢子的平板倒掉残余的悬浮液，放在载物台 上平均每个(IOX)视野中查找只有1-2个萌发的游动孢子。7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述方法中用手术刀在火焰上灭菌冷却 后，在（IOX)视野中查找到的单个游动孢子周围（倒置显微镜镜头正上方)培养基上切个长 0.5cm的正方形切痕，再一次确认切痕中只有1个游动孢子。8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于：用手术刀取出确认为带有1个游动孢子的 培养基小块后，放入另一个带有青霉素(50yg/mL)的V8琼脂培养基平板中，然后放入恒温箱 中25°C黑暗培养3d，挑取边缘的菌丝纯化至试管中，即得到辣椒疫霉游动孢子单孢株。9. 根据权利要求2-8任一所述的方法，其特征在于：所述方法中的操作均需要无菌操 作，在无菌操作台内进行。10. 权利要求1-9任一所述方法在辣椒疫霉游动孢子单孢株分离中的应用。
【文档编号】C12N3/00GK105886451SQ201610265019
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年4月26日
【发明人】李永刚, 陈雅君, 张铉哲
【申请人】东北农业大学