腈水解酶突变体、基因、载体、工程菌及应用
【专利说明】腊水解酶突变体、基因、载体、工程菌及应用 (-)技术领域
[0001] 本发明设及一种腊水解酶，特别设及一种利用基因突变获得的腊水解酶突变体及 其在制备医药中间体(R)-扁桃酸中的应用。 (二)【背景技术】
[0002] 腊水解酶化C 3.5.5.1):腊水解酶超级家族中一类重要的工业用酶，含有一个特 定的空间结构，蛋白结构单元由一个α-β-β-α的Ξ明治结构组成，腊水解酶的运种结构已经 通过X-ray衍射技术得到确认。根据蠕虫NiFMt晶体结构分析，其活性部位含有Glu-Lys-切S 3个残基，Brenner小组推测整个腊水解酶大家族可能是通过Glu-Lys-切S 3个残基来 催化的。腊水解酶的反应机理如图1所示，腊水解酶先攻击CN共价键，形成酶与底物共价结 合的中间体，继而加上一分子的水，并放出一分子的氨，当加上第二分子的水时，生成酸和 酶。腊水解酶的半脫氨酸残基上的琉基具有很强的亲核性，使整个过程类似于一般化学反 应中碱催化下的氯基水解。腊水解酶的主要功能在于水解腊类化合物生成相应的簇酸。按 照催化底物的不同，可W将腊水解酶分为^大类，即脂肪腊水解酶（aliphatic nitrilase)、芳香腊水解酶(aromatic nihilase,主要水解芳香腊、杂环腊)和芳基脂肪腊 水解酶(a巧laliphatic nitrilase)。利用腊水解酶的催化活性是降解环境污染中高毒性 腊的有效途径。故腊水解酶不但能应用于环境污染问题，而且能生产重要的医药中间体。在 自然界中，腊水解酶来源广泛，主要有细菌，丝状真菌，酵母，植物等，并W细菌为主要来源。 从生物技术应用角度，微生物腊水解酶作为绿色催化剂更具有商业价值。
[0003] 扁桃酸(mandelic acid)又称作苦杏仁酸、苯乙醇酸或α-径基苯乙酸。其中光学纯 (R)-扁桃酸(式I)是一种重要的精细化工中间体和手性药物前体，广泛应用于多种光学活 性药物的合成，如头抱菌素和半合成青霉素等抗生素、抗肿瘤药物、减肥药物、农药及其他 药物。（R)-扁桃酸还是重要的手性拆分剂和手性催化剂，而且还能用于测定手性物质的绝 对构型及光学纯度等。(R)-扁桃酸被称为"万能"拆分剂，其对醇胺类药物的拆分效果优秀， 如止咳药甲吗南的中间体八氨异喧琳衍生物，并且W(R)-扁桃酸为催化剂可将芳香族及脂 肪族醒均不对称转化成为相应手性醇。据统计，国际上已有部分公司有能力合成光学纯 (R)-扁桃酸，主要有日东化学公司、日本山川药品公司W及德国瓦克公司等。目前，国内也 已经有部分企业能够生产光学纯的扁桃酸，但还没有出现规模化生产单一构型的报道。因 此，加大力度对单一构型扁桃酸的研究开发，打破国外企业对手性(R)-扁桃酸的市场垄断， 并寻找适合我国工业化生产的方法意义重大。与此同时，研究出新的生产工艺用于(R)-扁 桃酸和其他手性药物的工业生产，不仅对满足我国光学活性药物产品市场的需要具有实际 意义，而且对解决手性技术领域所存在的多种问题也具有重大的理论指导意义。
[0004]
[000引（I)(R)-扁桃酸
[0006] 由于生物酶对底物有高度的立体选择性，具有严格的区域选择性和对映体选择 性，可直接将化学合成的外消旋衍生物、潜手性化合物或前体转化成单一对映异构体的光 学活性产物。生物催化的手性反应还具有效率高、反应条件溫和、反应步骤少、产品光学纯 度高等优点，并且生物催化过程能耗低、无毒、无污染，符合21世纪"绿色化学"的要求，被认 为是手性药物生产取得突破的关键技术。腊水解酶是一类可W将腊转化成相应酸的酶，当 W扁桃腊为底物时，腊水解酶将其不对称水解成(R)-扁桃酸，并且它的理论动力学反应产 物收率是100%，生产合成路线如图2。
[0007] 化mamoto等人报道来源于Alcaligenes faecalis ATCC8750的扁桃腊水解酶 (Appl.Environ.Microbiol 1991,57:3028-3032)能够催化外消旋扁桃腊的动态动力学水 解拆分得到扁桃酸，得率为91%，对映体过量值为100%。3〇331等对来源于41。日11旨日1168 faecaliS ATCC8750进行了固定化和修饰，固定化后的腊水解酶能高度选择性水解扁桃腊 成（R)-扁桃酸，pH为8.5时，收率为99%，产物ee值为99% (Journal of agricultural and food chemistry.2004,52(26):8155-8162)。
[000引 Rustler等人报道了来源于Pseudomonas fluorescens邸C191的重组菌在抑为5 时，能够水解扁桃腊，并且保持高的对映体选择性化nzyme Microb Tech 40(2007)598-606) eKiziak等人将来源于Pseudomonas fluorescen邸C191的腊水解酶基因克隆到表达 载体PJ0E2775中，并在大肠杆菌中表达。重组腊水解酶用于水解扁桃腊生成(R)-扁桃酸，但 ee值仅有31 %，且有19%的副产物酷胺生成(Microbiolog厂S卵.2005，151:3639-3648)。 [0009] Wang等人报道基于系统发育的酶与底物特异性预?1，从Burkholderia cenoc巧acia J2315中筛选得到一株新的腊水解酶BCJ2315(BMC.Biotechnology 13(2013) 13-14)，其水解扁桃腊生产（R)-扁桃酸的对映体选择性有98.7%，无副产物。重组 Escherichia coli M15/BCJ2315湿菌体（lOmg/ml)能够在化内完全水解lOOmM扁桃腊。
[0010] 虽然目前在利用腊水解酶催化生产(R)-扁桃酸方面已有一定的进展，但是，发现 的腊水解酶在工业生产中仍然存在着许多问题如高浓度的底物抑制，许多反应参数需要进 一步改进。所W行业仍需要具有更高活性，更严格对映选择性，更宽特异性或更好稳定性的 新腊水解酶，W降低生产工业生产成本。新酶的发现主要是基因组挖掘和宏基因组方法。蛋 白质工程的目的是改变对底物特异性，酶活性W及立体选择性。 (Ξ)
【发明内容】
[0011] 本发明目的是通过定点突变的方法对腊水解酶基因进行改造，改造后的腊水解酶 工程菌在催化外消旋扁桃腊的酶活性W及立体选择性方面都有提高，使其符合工业化生产 (R)-扁桃酸的应用需求。
[0012] 本发明采用的技术方案是：
[0013] 本发明提供一种腊水解酶突变体，所述突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列 的第190位丝氨酸进行定点突变获得的，优选将第190位丝氨酸突变为甘氨酸(Serl90Gly， 核巧酸序列为SEQ ID NO. 11所示，氨基酸序列为SEQ ID NO. 12所示)或精氨酸(Serl90A巧， 核巧酸序列为SEQ ID NO.9所示，氨基酸序列为SEQ ID NO. 10所示）。
[0014] 本发明设及一种所述腊水解酶突变体的编码基因，由所述腊水解酶突变体编码基 因构建的重组载体，W及由所述重组载体转化制备的重组基因工程菌。
[0015] 此外，本发明还提供一种所述腊水解酶突变体在催化扁桃腊制备(R)-扁桃酸中的 应用，具体所述应用为：W含腊水解酶突变体编码基因的重组工程菌经诱导培养后离屯、获 得的湿菌体用抑7.5、0.1mol/L的化is-HCl缓冲液悬浮制成的菌悬液为酶源，W外消旋扁 桃腊为底物，W抑为4-9(优选抑值为7.5Tris-肥1)的抑缓冲液为反应介质，在30-70°C(优 选40°C)、20化pm条件下反应(反应过程中优选流加1M氨水维持反应液抑为7.5)，反应结束 后，获得含(R)-扁桃酸的混合液，将混合液分离纯化，获得(R)-扁桃酸。所述湿菌体的用量 W反应介质体积计为1 -1 Og/L，所述底物用量W反应介质体积计为20~1 OOmmo 1/L。
[0016] 本发明所述湿菌体按如下方法制备:将含腊水解酶突变体编码基因的重组工程菌 接种至含终浓度50yg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37°C、150rpm/min振荡培养lOh;培养 液W体积浓度2%接种量接种到新鲜的含有终浓度50yg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37 °C、150rpm/min振荡培养至菌体0〇6日日=0.6~0.8，加入终浓度0.5mM的IPTG，28°C、150巧m/ min诱导培养lOh，于4°C、9000巧m/min离屯、lOmin，收集湿菌体。
[0017] 本发明所述的腊水解酶突变体可工程菌全细胞形式使用，也可W是未经纯化 的粗酶形式使用，也可W是部分纯化的或完全纯化的酶的形式使用。还可W利用本领域已 知的固定化技术将本发明的腊水解酶突变体制成固定化酶或者固定化细胞形式的固化酶。
[0018] 与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在:本发明所述的腊水解酶突变体(氨 基酸序列为SEQ ID NO.12所示)较亲本腊水解酶(氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示）比酶活 提高3.0倍，达到1.87U/mg，对映体选择性从94%提高到大于99%。结果表明，腊水解酶突变 体(氨基酸序列为SEQ ID ^.12所示)能够用少量湿菌体(10肖/1)在3〇111111内完全水解10〇11^ 扁桃腊，对映体选择性大于99%。可用于工业化生产医药中间体(R)-扁桃酸。 (四）
【附图说明】
[0019] 图1腊水解酶催化机理示意图。
[0020] 图2腊水解酶催化外消旋扁桃腊，生成(R)-扁桃酸的合成路线图。
[0021] 图3为重组大肠杆菌Serl90Gly的蛋白电泳图，泳道1为超声破粹后的混合悬液，泳 道2为纯蛋白，泳道3为标准蛋白。
[0022] 图4为亲本和第190位丝氨酸突变体催化扁桃腊活性及对映体选择性对比图。
[0023] 图5为溫度对重组大肠杆菌化21(DE3)/祀T28b-Serl90Gly催化的影响图。
[0024] 图6为抑对重组大肠杆菌化21(DE3)/祀T28b-Serl90Gly催化的影响图。 (五)
【具体实施方式】
[0025] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：
[00%]实施例1:亲本腊水解酶的基因合成
[0027]亲本腊水解酶的基因（GeneBank:AY487562)，为了使该基因连接到载体祀T28b后 可W表达带有化S-化g的蛋白，切除其终止密码子，并WE.coli的密码子偏好性为参照对其 序列进行优化，并且在起始密码子处引入化〇1，从而在甲硫氨酸后插入甘氨酸。新设计的腊 水解酶基因（tegi)的序列如SEQ ID N0.1所示(氨基酸序列为SEQ ID ^.2所示），基因合成 工作委托上海旭冠生物科技发展有限公司完成，基因合成后连接到表达载体祀T28b中。 [00%]实施例2:突变体库的构建
[0029] W实施例1获得的SEQ ID NO. 1所示核巧酸序列的亲本序列为模板，分别W下列核 巧酸序列(表1)为引物进行PCR扩增，分别获得将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的第190位丝 氨酸突变为丙氨酸，亮氨酸，鄉氨酸，甘氨酸，苏氨酸，半脫氨酸，精氨酸，赖氨酸，组氨酸，谷 氨酸的单突变体。
[0030] 表1:引物
[0033] PCR反应体系为：
[0031]
[0032]
[0034]
[0035] PCR 程序设定为:95°C 预变性 5min; 95°C 变性 15s，55°C 退火 30s，72°C 延伸 7min，30 个循环;72°C终延伸lOmin，4°C保藏。
[0036] PCR结束后，取20化PCR产物经Ο . 9 %琼脂糖凝胶电泳检测。对检测结果为阳性的 PCR产物，加入Dpn I，37°C酶切化。
[0037] 酶切反应体系如下：<