一种催化甲醇制备异戊二烯的大肠杆菌基因工程菌及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种催化甲醇制备异戊二締的大肠杆菌基因工程菌及其制备方法与 应用，属于基因工程技术领域。
【背景技术】
[0002] 中国是世界甲醇大国，产能超过世界的50%,2014年国内产能超过6000万吨， 2015年预计会超过6500万吨。根据国际经验，产能利用率保持在81 %~82%之间是衡量 工业产能是否过剩的临界点。从近年来国内甲醇行业平均开工率数据来看，我国甲醇开工 率一直在60%W下，2013年甲醇平均开工率为57. 13%，处于严重过剩的状态。国内甲醇 产能过剩，加上进口甲醇价格较低，致使国内甲醇的价格持续下降，2014年维持在1500~ 2000元/吨左右。
[0003] 甲醇精细化工产品的生产，能够有效应对甲醇生产过剩的局面，对于我国甲醇工 业行业的发展和市场的深化拓展有着重要意义。下游产品比之甲醇有更多的发展空间，能 够生产出更多的分支产品，而且下游产品在环保和节能方面与甲醇相比更具优势，更符合 世界工业的新理念。基于W上优点，大力研发甲醇下游产品，生产高附加值的精细化工产品 是甲醇类产品发展的大趋势。
[0004] 甲醇的下游产品开发可W通过化学转化和生物转化另种方法实现。化学转化途 径，研究较多的是W甲醇为原料制取締控、二甲酸、乙酸和甲醒等附加值较低的物质。化学 转化离不开贵金属催化剂，提高了生产升本。同时，催化剂的选择性和原料的转化率较低、 副产物较多、污染严重等问题的存在严重制约了产业的发展。相比较而言，生物方法污染 小、成本较低、可W实现原料的高效转化。 阳〇化]甲醇的生物转化利用处于探索阶段。W甲醇为碳源，通过微生物转化可W获得一 些附加值较高的发酵产物。Eugenio实现了W甲醇为碳源，利用工程Pichiapastoris合 成乙肝病毒表面抗原。Pichiapastoris在Pichiapastoris体内过表达编码婢虫蛋白的 基因后，可W利用甲醇合成婢虫疫苗。S化art等在Pichiapastoris细胞内过表达水赔素 合成基因，发酵4天得到1.5g/L水赔素。张元兴等采用甲醇甘油混合流加的方法使重组毕 赤酵母细胞干重达到162g/l，最终得到1. 7g/L的水赔素；还对发酵液的脱色和水赔素的分 离进行了探讨。一些科研工作者开展了甲醇单细胞蛋白的研究，发现利用甲醇作原料，通过 微生物发酵法生产的单细胞蛋白含有丰富的氨基酸，可W作为安全的饲料添加剂。已有的 关于甲醇生物利用的研究，主要通过甲基营养型菌株的简单培养来验证少数几种产品的生 产。总的来说，研究基础比较薄弱，存在诸多亟待解决的问题。
[0006] 异戊二締是战略资源性化工原料，供需不平衡。异戊二締产量的95%用于合成橡 胶，此外，也可应用于高品质航空燃料等领域。目前制作轮胎的主要原料是天然橡胶和合成 橡胶（聚异戊橡胶）。聚异戊橡胶因其分子结构及物化性质与天然橡胶相近，是替代天然 橡胶制造橡胶轮胎的理想原料。随着我国汽车行业的快速发展，W及我国天然橡胶原料日 益短缺，对异戊二締的需求量不断增加，预计2010年国内异戊二締需求量将达10. 54万吨， 2013年增长到31. 04万吨，年增速46%左右，然而，我国异戊二締产量不足，需要大量进口， 价格不断攀升，成为制约我国相关产业发展和战略安全的重要原料。
[0007] 目前，工业上主要是通过化学法从石油基原料中制备异戊二締。全球异戊二締主 要生产国家或地区主要分布在欧美地区。俄罗斯是异戊二締生产大国，产量约占全球29 %， 美国约占18%、日本约占15%。其次为己西、西欧、加拿大等。俄罗斯等国从战略上考虑， 限制异戊二締生产技术对我国的出口，而我国异戊二締天然资源匿乏，化学法规模化异戊 二締生产技术在产品成本、纯度等方面尚不成熟，制约着相关产业的发展，自主研发异戊二 締合成技术迫在眉睫。随着化石资源的日益枯竭和价格的不断攀升，拓宽原料来源，利用生 物技术制备异戊二締已成为国际上战略高技术的必争之地。已经报道利用葡萄糖为碳源合 成异戊二締，其产量和产率较低，同时葡萄糖市场价格高于甲醇且波动较大。
【发明内容】
[0008] 为解决W上问题，本发明提供了一种催化甲醇制备异戊二締的大肠杆菌基因工程 菌的制备方法，所采取的技术方案如下：
[0009] 本发明的目的在于提供一种催化甲醇制备异戊二締的大肠杆菌基因工程菌，该大 肠杆菌基因工程菌是过表达甲醇脱氨酶基因MDH，6-憐酸己酬糖合成酶基因RmpA，6-憐 酸-3-己酬糖异构酶基因Rm地和甲醇脱氨酶激活蛋白基因ACT。
[0010] 优选地，所述甲醇脱氨酶基因MDH，来源于甲基营养型芽抱杆菌度acillus methanoli州S)，基因登录号GI:662720579 ;所述6-憐酸己酬糖合成酶基因RmpA，来源于 甲基营养型芽抱杆菌，基因登录号GI:40074227 ;所述6-憐酸-3-己酬糖异构酶基因Rm地， 来源于甲基营养型芽抱杆菌，基因登录号GI:40074228 ;所述甲醇脱氨酶激活蛋白基因 ACT,来源于甲基营养型芽抱杆菌，基因登录号GI:22654851。
[0011] 优选地，还过表达合成异戊二締的相关基因，具体为脱氧木酬糖5-憐酸合成酶基 因dxr，脱氧木酬糖5-憐酸还原酶dxr，异戊締基焦憐酸异构酶idi和异戊二締合成酶基因 Ispso
[0012] 本发明的另一目的是提供一种所述大肠杆菌基因工程菌的构建方法，该方法的步 骤如下：
[0013] 1)克隆或合成获得甲醇脱氨酶基因MDH，6-憐酸己酬糖合成酶基因RmpA，6-憐 酸-3-己酬糖异构酶基因Rm地和甲醇脱氨酶激活蛋白基因ACT,并将所得基因与质粒 PBAD18酶切回收，目的片段和载体；
[0014] 2)将步骤1)所得的载体和目的片段按照等摩尔比混合后利用连接酶连接，并转 入感受态细胞中，筛选阳性克隆；
[0015] 3)培养步骤2)所得的阳性克隆，并提取质粒将步骤1)所述的四个基因连接在质 粒地AD18上，获得重组质粒地AD18-MDH-RmpA-Rm地-ACT;
[0016] 4)构建具有异戊二締合成途径的重组质粒，并将所得的重组质粒与步骤3)所得 的重组质粒地AD18-MDH-RmpA-Rm地-ACT,-同转化到大肠杆菌E.coliBL21 (DE3)中，获得 大肠杆菌基因工程菌。
[0017] 优选地，步骤1)所述甲醇脱氨酶基因MDH，来源于甲基营养型芽抱杆菌度acillus methanoli州s)，基因登录号GI:662720579 ;所述6-憐酸己酬糖合成酶基因RmpA，来源于 甲基营养型芽抱杆菌，基因登录号GI:40074227 ;所述6-憐酸-3-己酬糖异构酶基因Rm地， 来源于甲基营养型芽抱杆菌，基因登录号GI:40074228 ;所述甲醇脱氨酶激活蛋白基因 ACT,来源于甲基营养型芽抱杆菌，基因登录号GI:22654851。 阳0化]优选地，步骤。所述连接酶为T4DNA连接酶，连接时间为6~12小时；所述感受 态细胞，为经过热激转化的E.coliD册α感受态细胞；所述筛选，是利用涂布氯霉素或卡那 霉素抗性平板过夜培养，PCR筛选。
[0019] 优选地，步骤4)所述具有异戊二締合成途径的重组质粒，包含脱氧木酬糖5-憐酸 合成酶基因dxr，脱氧木酬糖5-憐酸还原酶dxr，异戊締基焦憐酸异构酶idi和异戊二締合 成酶基因Isps。
[0020] 所述任一大肠杆菌基因工程菌在生产异戊二締中的应用也在本发明的保护范围 之内。
[0021] 所述应用的步骤如下：
[0022] 1)活化大肠杆菌基因工程菌，获得种子液；
[002引。将步骤1)所得的种子液，与含有卡那霉素和氯霉素的培养基，按照种子液：培 养基=1~2:100~130的比例接种后培养至ODe。。在1. 8~2,离屯、获得菌体；
[0024] 3)向步骤2)所得的菌体重悬后加入新鲜培养基中，并加入诱导剂IPTG和阿拉伯 糖至终浓度分别为