株单克隆加入含有卡那霉素和氯霉素的适宜培养基中，在37°C， 18化pm条件下进行活化获得种子液，将种子液W1:100的比例接入W上培养集中继续培 养。菌体浓度生长至ODe。。为2左右，在无菌环境下回收菌体。回收后的菌体用5mL培养基 进行重悬，加入含有95mL培养基的500mL体积的盐水瓶中，同时加入诱导剂IPTG和阿拉伯 糖至终浓度分别为0. 〇5mM和0. 02%，并利用下基橡胶塞密封。转入30°C，ISOrpm条件下继 续培养，诱导目的蛋白进行过量表达。培养24小时后，取培养瓶内培养基上方空气，通过气 相检测产物。
[0054] 经检测，异戊二締的产量为297mg/l，甲醇到异戊二締转化率为12. 9%，相对于实 施例3中的工程菌，产量和转化率分别提高了 36. 8%和37. 2%。 阳05引实施例5将质粒地AD18-MDH-RmpA-Rm地-ACT与异戊二締合成质粒导入大肠杆菌E.coliBL2UDE3)合成异戊二締
[0056] 将实施例2所得的重组质粒地AD18-MDH-RmpA-Rm地-ACT与异戊二締合成质粒同 时加入到E.coliBL21 (DE3)感受态细胞中；冰浴20min，冰浴后的感受态细胞放入42°C 水浴锅热激45s，热激后立即冰浴2min;在超净台内，加入600μ1灭菌的LB液体培养基 到感受态细胞所在的离屯、管内；将离屯、管置于37°C摇床培养比；摇床培养后，500rpm离屯、 2min，用移液枪吸出上清液，留少许上清液重悬细胞，并涂布于含有卡那霉素和氯霉素的LB 固体平板；涂布后的平板置于37Γ恒溫培养箱，继续培养至长出单克隆。
[0057] 将获得的工程菌株单克隆加入含有卡那霉素和氯霉素的适宜培养基中，在37°C， 18化pm条件下进行活化获得种子液，将种子液W1:100的比例接入W上培养集中继续培 养。菌体浓度生长至ODe。。为2左右，在无菌环境下回收菌体。回收后的菌体用5mL培养基 进行重悬，加入含有95mL培养基的500mL体积的盐水瓶中，同时加入诱导剂IPTG和阿拉伯 糖至终浓度分别为0. 〇5mM和0. 02%，并利用下基橡胶塞密封。转入30°C，ISOrpm条件下继 续培养，诱导目的蛋白进行过量表达。培养24小时后，取培养瓶内培养基上方空气，通过气 相检测产物。
[0058] 经检测，异戊二締的产量为343mg/l，甲醇到异戊二締转化率为21. 83%。相对于 实施例中4中没有过表达甲醇脱氨酶激活蛋白基因ACT的工程菌，产量和转化率分别提高 了 32. 32%和 69. 22%。
[0059] W上实施例仅用W说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照上述实 施例对本发明进行了详细地说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可W对前述实施 例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而运些修改或替 换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
【主权项】
1. 一种催化甲醇制备异戊二烯的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，具有异戊二烯合 成途径，同时，过表达甲醇脱氢酶基因MDH，6-磷酸己酮糖合成酶基因RmpA，6-磷酸-3-己 酮糖异构酶基因RmpB和甲醇脱氢酶激活蛋白基因ACT。2. 根据权利要求1所述的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述甲醇脱氢酶基因 MDH，来源于甲基营养型芽孢杆菌（Bacillusmethanolicus)，基因登录号GI:662720579 ; 所述6-磷酸己酮糖合成酶基因RmpA，来源于甲基营养型芽孢杆菌，基因登录号GI: 40074227 ;所述6-磷酸-3-己酮糖异构酶基因RmpB，来源于甲基营养型芽孢杆菌，基因登 录号GI:40074228 ;所述甲醇脱氢酶激活蛋白ACT基因，来源于甲基营养型芽孢杆菌，基因 登录号GI:ΑΥ128667· 1。3. 根据权利要求1所述的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述具有异戊二烯合成 途径，是指过表达脱氧木酮糖5-磷酸合成酶基因dxr，脱氧木酮糖5-磷酸还原酶dxr，异戊 烯基焦磷酸异构酶idi和异戊二稀合成酶基因Isps。4. 一种权利要求1所述大肠杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤如下： 1) 克隆或合成获得甲醇脱氢酶基因MDH，6-磷酸己酮糖合成酶基因RmpA，6-磷 酸-3-己酮糖异构酶基因RmpB和甲醇脱氢酶激活蛋白ACT基因，并将所得基因与质粒 PBAD18酶切回收，目的片段和载体； 2) 将步骤1)所得的载体和目的片段按照等摩尔比混合后利用连接酶连接，并转入感 受态细胞中，筛选阳性克隆； 3) 培养步骤2)所得的阳性克隆，并提取质粒将步骤1)所述的四个基因连接在质粒 PBAD18 上，获得重组质粒pBAD18-MDH-RmpA-RmpB-ACT; 4) 构建具有异戊二烯合成途径的重组质粒，并将所得的重组质粒与步骤3)所得的重 组质粒pBAD18-MDH-RmpA-RmpB-ACT，一同转化到大肠杆菌E.coliBL21 (DE3)中，获得大肠 杆菌基因工程菌。5. 根据权利要求4所述方法，其特征在于，步骤1)所述甲醇脱氢酶基因MDH，来源于 甲基营养型芽孢杆菌（Bacillusmethanolicus)，基因登录号GI:662720579 ;所述6-磷 酸己酮糖合成酶基因RmpA，来源于甲基营养型芽孢杆菌，基因登录号GI:40074227 ;所 述6-磷酸-3-己酮糖异构酶基因RmpB，来源于甲基营养型芽孢杆菌，基因登录号GI: 40074228 ;所述甲醇脱氢酶激活蛋白ACT基因，来源于甲基营养型芽孢杆菌，基因登录号 GI:AY128667. 1。6. 根据权利要求4所述方法，其特征在于，步骤2)所述连接酶为T4DNA连接酶，连接 时间为6~12小时；所述感受态细胞，为经过热激转化的E.coliDH5α感受态细胞；所述筛 选，是利用涂布氯霉素或卡那霉素抗性平板过夜培养，PCR筛选。7. 根据权利要求4所述方法，其特征在于，步骤4)所述具有异戊二烯合成途径的重组 质粒，包含脱氧木酮糖5-磷酸合成酶基因dxr，脱氧木酮糖5-磷酸还原酶dxr，异戊烯基焦 磷酸异构酶idi和异戊二烯合成酶基因Isps。8. 权利要求1-3所述任一大肠杆菌基因工程菌在生产异戊二烯中的应用。9. 权利要求8所述应用，其特征在于，步骤如下： 1) 活化大肠杆菌基因工程菌，获得种子液； 2) 将步骤1)所得的种子液，与含有卡那霉素和氯霉素的培养基，按照种子液：培养基 =1~2:100~130的比例接种后培养至0D6。。在1. 8~2,离心获得菌体； 3)向步骤2)所得的菌体重悬后加入新鲜培养基中，加入诱导剂IPTG和阿拉伯糖至终 浓度分别为〇· 05~0· 5mM和0· 002 %~0· 02 %，然后转入28~30 °C，180~220rpm条件 下继续培养24~72小时。10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，步骤2)所述培养，培养条件为：35°C~ 37°C，180 ~220rpm。
【专利摘要】本发明公开了一种催化甲醇制备异戊二烯的大肠杆菌基因工程菌及其制备方法与应用，属于基因工程技术领域。本发明所提供的大肠杆菌基因工程菌具有异戊二烯合成途径，同时过表达甲醇脱氢酶基因MDH，6-磷酸己酮糖合成酶基因RmpA，6-磷酸-3-己酮糖异构酶基因RmpB和甲醇脱氢酶激活蛋白基因Act。同时，本发明还提供了构建该大肠杆菌基因工程菌的方法及应用方法。本发明所提供的大肠杆菌基因工程菌可以甲醇为底物生物合成异戊二烯，具有转化效率高，生产成本低等特点，甲醇-异戊二烯的转化率可达21.83％。
【IPC分类】C12P5/02, C12N1/21, C12R1/19, C12N15/70
【公开号】CN105255804
【申请号】CN201510771229
【发明人】咸漠, 唐勇, 赵广, 廖本仁, 冯新军, 揭元萍, 刘会洲, 张春雷
【申请人】中国科学院青岛生物能源与过程研究所, 上海华谊（集团）公司
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年11月12日