一种γ -谷氨酰转肽酶与伴侣蛋白共表达重组质粒构建方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，具体地说，是关于构建一株具有极高谷氨酰转肽 酶转移酶活性的大肠杆菌基因工程菌，通过酶转化合成茶氨酸的生产方法。
【背景技术】
[0002] L-茶氨酸（N-乙基-γ谷氨酰胺，theanine)是一种天然的氨基酸，是茶叶中的特 征氨基酸，也是茶叶中有效的呈味物质。L-茶氨酸主要用于：（1)作为一种新兴的食品添 加剂，可用作为茶饮料的品质改良剂、改善食品风味的添加剂、功能食品的添加剂、"情绪食 品"的添加剂等；已在欧美、日本、中国台湾等国家、地区广泛使用。如日本已开发出添加茶 氨酸的巧克力、果冻、布丁、口香糖、保健茶和各种清凉饮料。（2)作为医药中间体领域，茶氨 酸可以用作抗肿瘤、降血压、安神镇静、抗疲劳等药物中。此外L-茶氨酸现已作为镇静剂中 的有效成分，对帕金森氏症、老年性痴呆、传导神经功能紊乱等疾病起预防效果。
[0003] L-茶氨酸的生产方法主要有茶叶提取法、化学合成法、微生物发酵酶转化法。（1) 茶叶提取法由于茶叶中茶氨酸的含量不高，从茶叶提取茶氨酸无实际生产价值。所以植物 提取法实际上是从提取茶多酚后的残留液中用离子交换树脂法提取茶氨酸。缺点是生产工 序复杂、产品纯度低、产量小、价格高。（2)化学合成L-茶氨酸需要高温、高压及化学催化 剂等条件，反应条件要求比较高，副产物多，且产生的都是DL-型消旋体，还需要进行拆分 才能得到L-型产品。因此会使成本提高以及质量难以控制，且易混杂有毒物质，产品不宜 用于食品行业应用，同时生产工艺复杂，且易造成环境污染。（3)微生物发酵酶转化法生产 的L-茶氨酸都是L型的，且生产成本低，可大量生产，由于生物酶法合成具有高度的专一 性，所以在产品质量方面更接近天然的L-茶氨酸，其发展前景非常广阔。此外酶转化法生 产L-茶氨酸还具有纯度高、副产物少、纯化步骤少、生产能力强等优点，因此微生物发酵酶 转化法是目前国内外研宄人员公认的最直接、最经济的L-茶氨酸生产方法。
[0004] 利用微生物发酵酶转化法生产L-茶氨酸的酶主要有谷氨酰胺酶和γ -谷氨酰转 肽酶（γ-GGT)，本实验是研宄利用大肠杆菌发酵产γ-谷氨酰转肽酶，该大肠杆菌高产高 酶活的γ-谷氨酰转肽酶，能高效转化谷氨酰胺和乙胺为L-茶氨酸；近些年来，尽管有研宄 把大肠杆菌Κ-12来源的γ-ggt基因（全长序列或突变缺失序列）导入到大肠杆菌中表达， 通过采用不同的融合标签的载体或大小亚基的共表达，但重组谷氨酰转肽酶常常以没有活 性的包涵体或没有活性的酶原形式被表达出来。宄其原因，主要是谷氨酰转肽酶复杂的翻 译后加工过程，造成表达和转运后的大小亚基不能正确折叠并且不能有效地相互作用，因 此不能形成天然的成熟酶。这样的事实使得高效过表达具有生物活性的谷氨酰转肽酶成为 一个难题。因而，寻求新的方法改进基因工程菌株以从根本上提高茶氨酸的合成量显得尤 为重要。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的是提供一种伴侣蛋白或伴侣蛋白组合分别与谷氨酰转肽酶共 表达的系统，用于构建高效表达谷氨酰转肽酶的菌株，以便于酶转化合成茶氨酸。
[0006] -种具有谷氨酰转肽酶酶活的大肠杆菌基因工程菌，该基因工程菌是以大肠杆菌 BL21 (DE3)为宿主菌，宿主菌中共转化有伴侣蛋白表达质粒pG-Tf2与谷氨酰转肽酶表达质 粒。
[0007] 本发明还公开了所述大肠杆菌基因工程菌在生产茶氨酸中的应用。
[0008] 一种利用谷氨酰转肽酶重组质粒生产茶氨酸的方法，是用伴侣蛋白表达质粒 pG-Tf2与谷氨酰转肽酶表达质粒共转化大肠杆菌得到共转化子，诱导培养该共转化子；以 经诱导培养的共转化子为酶源，谷氨酰胺和乙胺为转化底物，酶促合成茶氨酸。
[0009] 上述方法中，诱导培养条件优选如下：将共转化子菌液接入含有氨苄青霉素和氯 霉素抗性液体TB培养基中，其中，TB培养基中加有lOng/ml四环素作为伴侣蛋白的诱导剂； 振荡培养至0D600值为1. 2后，加入终浓度为0. 5mM的IPTG，20°C下诱导16h。
[0010] 本发明提供的利用谷氨酰转肽酶重组质粒生产茶氨酸的技术方案是在以下大量 实验的基础上获得的。：
[0011] (1)将5种伴侣蛋白表达质粒分别与谷氨酰转肽酶表达质粒共转化大肠杆菌 BL21(DE3)；
[0012] (2)谷氨酰转肽酶和伴侣蛋白在五种共表达体系中的蛋白诱导表达；
[0013] (3)五种共表达体系中，通过检测谷氨酰转肽酶的表达量及酶活，筛选出
[0014] pG_Tf2伴侣蛋白表达质粒的共转化子表现出最佳的谷氨酰转肽酶酶活；
[0015] (4)pG_Tf2伴侣蛋白表达质粒与谷氨酰转肽酶最佳共表达条件的优化；
[0016] (5)培养诱导表达极高谷氨酰转肽酶酶活的基因工程菌，以谷氨酰胺和乙胺为底 物，高效酶促合成茶氨酸。
[0017] 步骤（1)中，所选择的5种伴侣蛋白表达质粒见附表1，均带有氯霉素抗性；另外 谷氨酰胺转肽酶表达质粒为本实验室保留的名称为Pgex-4t-l/g St-ggt(参考：胥俊峰，单 建华，赵宁伟，殷志敏.大肠杆菌γ 2ggt原核表达载体pGEX-4T-l/ γ -ggt的构建及其蛋 白表达.安徽农业科学，2007, 35 (30) : 9467 - 9469)，带有氨苄青霉素抗性；双抗性方便筛 选共转化子。
[0018] 表1. 5种大肠杆菌伴侣蛋白质粒简介
[0019]
【主权项】
1. 一种具有谷氨酰转肽酶酶活的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于：该基因工程菌是 以大肠杆菌BL21 (DE3)为宿主菌，宿主菌中共转化有伴侣蛋白表达质粒pG-Tf2与谷氨酰转 肽酶表达质粒。
2. 权利要求1所述大肠杆菌基因工程菌BL21/C4在生产茶氨酸中的应用。
3. -种利用谷氨酰转肽酶重组质粒生产茶氨酸的方法，其特征在于：是用伴侣蛋白表 达质粒pG-Tf2与谷氨酰转肽酶表达质粒共转化大肠杆菌得到共转化子，诱导培养该共转 化子；以经诱导培养的共转化子为酶源，谷氨酰胺和乙胺为转化底物，酶促合成茶氨酸。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述的诱导培养条件如下：将共转化子菌 液接入含有氨苄青霉素和氯霉素抗性液体TB培养基中，其中，TB培养基中加有lOng/ml四 环素作为伴侣蛋白的诱导剂；振荡培养至OD600值为1. 2后，加入终浓度为0. 5mM的IPTG， 20°C下诱导16h。
【专利摘要】本发明提供了一种重组谷氨酰转肽酶共表达质粒的构建方法和应用、一种高效累积茶氨酸的方法。本发明通过伴侣蛋白与带有GST标签的谷氨酰转肽酶的共表达，成功构建了一株具有极高谷氨酰转肽酶酶活的大肠杆菌基因工程菌BL21/C4，共表达后最佳酶活达到15500U/L。使用本发明方法可以明显的提高酶的表达量及酶活，促进底物的转化，进而提高茶氨酸的生产量。同时，缩短了工艺周期(酶活性好)，降低了生产成本(降低酶促反应中酶耗成本)，易操作，易放大，稳定性好，适于大规模工业化生产，为生物酶法生产其它有价值的产品提供了新的思路。
【IPC分类】C12P13-04, C12N15-70, C12R1-19, C12N1-21
【公开号】CN104560849
【申请号】CN201410812443
【发明人】殷志敏, 王期, 蒋毅, 兰蕾
【申请人】南京师范大学
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2014年12月23日