重组菌株及其构建方法、应用
【技术领域】
[0001]本发明设及微生物领域，特别设及重组菌株及其构建方法、应用。
【背景技术】
[0002] 心鄉氨酸化-￥曰1；[]16)，化学名称为心〇-氨基异戊酸，分子式为〔5出1顯2，相对分子 质量为117.15。呈白色结晶或结晶性粉末，无臭，味苦，在水中溶解度:25 °C为88.5g/L，50°C 为96.2g/L，不溶于冷乙醇，乙酸，丙酬。等电点为5.96，烙点315°(：。
[0003] 心鄉氨酸化-Val)是人体八种必需氨基酸之一，又是Ξ种支链氨基酸（包括鄉氨 酸、亮氨酸、异亮氨酸)之一，因其特殊的结构和功能，在人类生命代谢中具有特别重要的地 位。可W广泛应用于医药工业、食品工业和饲料工业等。
[0004] 医药工业中，可作氨基酸输液、综合氨基酸制剂的主要成分，可治疗肝功能衰竭、 中枢神经系统功能素乱。如缺乏可引起神经障碍、停止发育、体重下降、贫血等。
[0005] 食品工业中，可用作食品添加剂、营养增补液及风味剂等。米制糕饼中添加鄉氨酸 (Ig/kg)，产品有芝麻香，用于面包亦能改善风味。心鄉氨酸也可用作氨基酸能量饮料与运 动员饮料，有形成肌肉、强化肝功能、减轻肌肉疲劳等作用。
[0006] 饲料工业中，对动物的乳腺组织分泌乳汁有重要的促进作用。将其用于维鸡饲料 中，可提高维鸡对鸡新城疫病毒的免疫能力。而且心鄉氨酸是动物饲料中的一种限制性氨 基酸，所鄉氨酸可作为饲料添加剂改善动物日粮中氨基酸含量的不足。
[0007] k鄉氨酸的生产方法有Ξ种:提取法、化学合成法、微生物发酵法。提取法和化学 合成法由于原料来源受限制、生产成本高、污染环境，难W实现工业化生产。微生物发酵法 生产心鄉氨酸具有原料成本低、反应条件溫和、容易实现大规模生产等优点，是目前生产k 鄉氨酸最主要的方法。通过菌株的选育，W解除代谢调节中的反馈抑制和阻遏，达到过量积 累心鄉氨酸的目的，是微生物发酵法工业应用最为广泛的手段。
[000引棒杆菌是用于生产L-氨基酸的代表性微生物，特别是谷氨酸棒杆菌 (Corynebacterium glutamicum)、北京棒杆菌（Corynebacterium pekinense)和黄色短杆 菌(Breviabacterium flavum)。为了改善运些微生物的1^-鄉氨酸生产能力，可W通过传统 诱变和代谢工程等方法对生产菌株进行不断地改造。
[0009] 传统诱变育种，是指通过对特定出发菌株进行物理、化学或二者合并地诱变处理， 再选育出营养缺陷型和/或氨基酸结构类似物抗性突变株，W解除代谢调节中的反馈抑制 或阻遏作用，从而达到过量积累某种氨基酸的目的。
[0010] 代谢工程育种，就是在对代谢网络系统分析的基础上采用基因工程技术改造细胞 代谢系统W提高产物得率或改进细胞性能。主要包括如下手段:对原有代谢途径的改造、新 代谢途径的构建、组学规模的代谢关键途径或祀点的识别。通过理性的代谢工程构建氨基 酸生产菌株，正逐渐成为氨基酸育种的主要策略。
[0011] 3-憐酸甘油醒脱氨酶是中屯、碳代谢途径中设及的一个酶。在棒状杆菌中，它W gapA的形式存在，WNAD作为辅酶，将3-憐酸甘油醒转化为1，3-二憐酸甘油酸，而P泌基因编 码的酶再将1，3-二憐酸甘油酸转化为3-憐酸甘油酸。与之相反，在链球菌和芽抱杆菌中，它 W非憐酸化的NADP依赖型GADPH(非憐酸化的NADP依赖型3-憐酸甘油醒脱氨酶，下文中称为 gapN)形式存在，其WNADP作为辅酶，将3-憐酸甘油醒转化为3-憐酸甘油酸，并产生NADPH。 该过程是个单步的过程，在糖酵解中扮演重要角色，并受到NADPH/NADP比例的影响。
[0012] 甘油醒3-憐酸脱氨酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，EC 1.2.1.9)是一种NADP+依赖型的氧化还原酶，它可逆地催化甘油醒3-憐酸反应生成1，3二憐 酸甘油酸，如下所示：
[0013] glyceraldehyde 3-phosphate+phosphate+NADP^ = 3-phosph〇-glyceroy1 地os地ate+NADPH+H+
[0014] 来源于变形链球菌（streptococcus mutans)ATCC25175的甘油醒3-憐酸脱氨酶具 有良好的热稳定性、化学稳定性和操作稳定性。NADH和NADra是细胞内重要的辅酶，参与糖、 月旨、蛋白质Ξ类物质代谢的绝大部分氧化还原反应，NAD/NADH和NADP/NADPH分别是其对应 的氧化还原对。
[0015] 将来源于变形链球菌的亮甘油醒3-憐酸脱氨酶编码基因 gapN导入到棒杆菌或黄 杆菌中，其编码产物可W将NADP转化为NADPH，从而增加 NADPH的供应，达到调节胞内NADH/ NADPH平衡的效果，转化并表达的结果是使胞内氧化还原平衡也相应得到改变。
[0016] 此类相似的应用，其他专利就是利用NADP依赖型3-憐酸甘油醒脱氨酶活性来达到 提高心赖氨酸产量棒状杆菌属菌株的方法。
[0017] 工程菌CGMCC 1.299自身的3-憐酸甘油醒脱氨酶WgapA的形式存在，WNAD作为辅 酶，将3-憐酸甘油醒转化为1，3-二憐酸甘油酸，而P泌基因编码的酶再将1，3-二憐酸甘油酸 转化为3-憐酸甘油酸。此过程中产生的是NADH，而不能在鄉氨酸末端合成的四步反应中应 用，从而一方面造成NADH的大量积累，另一方面合成需要的NADK1又不足。
【发明内容】
[0018] 有鉴于此，本发明提供重组菌株及其构建方法、应用。本发明设及分子改造棒杆菌 或短杆菌，并发酵生产k鄉氨酸的方法。具体地说，是将辅助因子为NADPH的甘油醒3-憐酸 脱氨酶gapN转化导入棒杆菌或短杆菌中，从而获得胞内氧化还原平衡改变的基因工程菌。 该基因编码的甘油醒3-憐酸脱氨酶可W将甘油醒3-憐酸转化为1，3二憐酸甘油酸。该基因 工程菌可用于发酵生产心鄉氨酸。
[0019] 为了实现上述发明目的，本发明提供W下技术方案：
[0020] 本发明提供了重组菌株，由编码gapN蛋白质的gapN基因导入生产k鄉氨酸的原始 菌株制得;所述原始菌株为棒杆菌或短杆菌。
[0021] 在本发明的一些具体实施方案中，所述重组菌株的所述原始菌株选自谷氨酸棒杆 菌(C.glutamicum)、北京棒杆菌(C.pekinense)和黄色短杆菌(B.f lavum)。
[0022] 在本发明的一些具体实施方案中，所述重组菌株中所述生产k鄉氨酸的原始菌株 为保藏编号为CGMCC 1.299的谷氨酸棒杆菌。
[0023] 在本发明的一些具体实施方案中，所述重组菌株中所述编码gapN蛋白质的gapN基 因 W重组质粒或插入染色体的方式导入所述原始菌株。
[0024] 在本发明的一些具体实施方案中，所述重组菌株中所述编码gapN蛋白质的gapN基 因的核巧酸序列如SEQ ID No. 1中自5'末端第1至1428位核巧酸所示。
[0025]在本发明的一些具体实施方案中，所述重组菌株中所述重组质粒的制备方法为将 所述gapN基因的核巧酸序列插入出发载体pXMJ 19的多克隆位点。
[00%]在本发明的一些具体实施方案中，所述重组菌株的保藏编号为CGMCC No. 11938。 [0027]本发明还提供了所述重组菌株发酵生产鄉氨酸中的应用。
[00%]本发明还提供了所述重组菌株的构建方法，将编码gapN蛋白质的gapN基因导入生 产心鄉氨酸的原始菌株;所述原始菌株为棒杆菌或短杆菌。
[0029] 本发明还提供了一种发酵生产心鄉氨酸的方法，发酵菌株为所述重组菌株或所述 构建方法构建的重组菌株。
[0030] 本发明保护将目标基因 W重组质粒或插入染色体等方式导入棒杆菌或短杆菌得 到的工程菌株;所述重组质粒为将gapN的基因序列插入出发载体阴MJ19的多克隆位点得到 的质粒。所述棒杆菌的编号为CGMCC 1.299。所述甘油醒3-憐酸脱氨酶编码的核巧酸序列如 SEQ ID No. 1中自5'末端第1至1428位核巧酸所示。
[0031] 用gapN，其WNADP为辅本科，将3-憐酸甘油醒转化为3-憐酸甘油酸，并产生NADPH。 而NADPH是鄉氨酸末端合成必须的辅助因子，每合成一分子鄉氨酸需要二分子的NADPH。从 而同时解决NADH的过剩与NADPH的不足，达到两者的平衡。
[0032] 摇瓶发酵生产k鄉氨酸实验结果表明：出发菌株CGMCC 1.299的心鄉氨酸产量为 3.2g/L，而本发明的工程菌MHZ-1011的^鄉氨酸产量为6.5g/L，比出发菌株产量提高 103%，与出发菌株相比，本发明提供的保藏编号为CGMCC No. 11938的重组菌株具有极显著 差异(P<0.01)。
[0033] 5化罐发酵生产k鄉氨酸实验结果表明：出发菌株CGMCC1.299的心鄉氨酸产量为 7.3g/L，而本发明的工程菌MHZ-1011的レ鄉氨酸产量为18.4g/L，比出发菌株产量提高 152%，与出发菌株相比，本发明提供的保藏编号为CGMCC No. 11938的重组菌株具有极显著 差异(P<0.01)。
[0034] 生物保藏说明
[0035] 生物材料Μ监-1011分类命名：谷氨酸棒杆菌，〔〇巧1166日(3161'；[11111旨1111日111；[州1]1于2015 年12月25日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、，地址为北京市朝阳区 北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No. 11938。
【附图说明】
[0036] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0037] 图1示阴MJ19-gapN质粒图谱。
【具体实施方式】
[0038] 本发明公开了重组菌株及其构建方法、应用，本领域技术人员可W借鉴本文内容， 适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来 说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例 进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文所述的方法和应 用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0039] 本发明的目的是提供一种生产心鄉氨酸的工程菌株。
[0040] 本发明的另一目的是提供利用该工程菌株生产心鄉氨酸的方法。
[0041] 本发明保护将目标基因 W重组质粒或插入染色体等方式导入棒杆菌或短杆菌得 到的工程菌株;所述重组质粒为将gapN的基因序列插入出发载体阴MJ19的多克隆位点得到 的质粒。所述棒杆菌的编号为CGMCC 1.299。所述甘油醒3-憐酸脱氨酶编码的核巧酸