一种修复重金属污染土壤的微生物菌株及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及微生物领域，具体的说是设及一种修复重金属污染±壤的微生物菌株 及其应用。
【背景技术】
[0002] 由于长期的矿山开采，金属冶炼W及含憐农药的施用，±壤中富集了大量重金属 污染物。重金属污染±壤具有隐蔽性，累积性和滞后性，因此不易引起重视。近年来，我国重 金属污染±壤问题日益突出，对耕地±壤质量和民生健康安全造成极大威胁。我国环境保 护部和国±资源部对全国±壤污染情况的调查结果显示，我国±壤受儒、神、铅、铭、儀等重 金属污染严重，污染场地面积近2万公顷，约占耕地总面积的1/5,其中全国±壤重金属儒的 超标率最高，达到了 7%。因此，儒污染的治理成为当前±壤污染领域亟待解决的重要问题 之一。
[0003] 重金属儒作为机体生长发育非必需元素，是对植物、动物及人类毒性最强的重金 属元素之一。重金属儒经过食物链产生生物放大作用，在较高级的生物体中富集起来，然后 通过食物等渠道进入人体。当重金属儒在人体内积累到一定限度，会造成人体急性或慢性 中毒，对人体器官特别是肾脏造成很大的危害。
[0004] 重金属污染±壤的修复方法可分为物理法、化学法W及生物法。物理方法往往工 程量大，能耗大;化学方法大多花费高，易造成二次污染;生物法中的植物修复受到较多研 究人员的青睐，但植物生长缓慢，修复周期长。目前比较受关注的修复技术大多处于实验室 试验阶段，且实验效果也不够理想，在实地修复中，我国并没有很好的成功案例。因此，寻找 一种高效节能，经济环保的修复措施至关重要。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种修复重金属污染±壤的微生物菌株及其应 用，使得所述微生物菌株对±壤中重金属儒具有较强的纯化作用W及耐受作用，通过纯化 作用将儒固定在污染±壤中，降低儒的生物有效性，减少植物对其吸收利用，从而达到修复 污染±壤的目的；
[0006] 本发明的另一个发明目的在于提供一种修复重金属污染±壤的微生物菌株及其 应用，使得所述微生物菌株能够提高±壤中，特别是重金属污染的±壤中的±壤脱氨酶活 性，改善±壤微生态环境。
[0007] 为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
[000引本发明针对现有治理重金属污染±壤的物理化学方法具有一定局限性，实施成本 高，并且对±壤破坏严重，易带来其他污染的问题。通过利用功能性微生物菌株的生物纯化 作用来实现对污染±壤的原位修复，具有成本低、效果好、操作方便、对±壤扰动小等特点。
[0009] 本发明利用液相富集法对儒纯化菌株进行了筛选。
[0010] 液相富集法:称取适量儒污染±壤样品加入到装有LB液体培养基的Ξ角瓶中，加 入适量玻璃珠。将Ξ角瓶在28-30°C，150-170巧m下振荡;将±壤混合液转入离屯、管，取离屯、 后的上清液作为儒纯化微生物的来源。将上述上清液接种到含有儒的LB液体培养基中，在 28-30°C，150-170巧m下振荡培养。用无菌吸管吸取l-2mL，移入另一个富集培养Ξ角瓶中。 如此转移Ξ次后，分别在LB固体培养基和无机盐固体培养基上进行平板划线，分离单菌落。 [00川将上清液分别稀释10-1、10-2、ΙΟΛΙΟΛΙΟΛΙΟΛ 10-7、10-8，吸取适量涂布于含有 50、100、200、300mg/L Cd2+的LB固体培养基上，28~30°C培养3-4d。发现在稀释10-4倍数情 况下易于该菌落的单独分离，可在300mg/L Cd2+浓度下正常生长，培养后取该条件下菌株划 线分离。
[0012] 通过上述方法，本发明筛选出一株微生物菌株，根据天根细菌基因组DNA提取试剂 盒(TIANamp bacteria DNA kit)步骤提取该菌株的DNA用于菌种鉴定。在比对匹配度最高 的结果中，菌种的所测得到的16S rDNA序列部分(SEQ ID N0:1所示)与洋葱伯克霍尔德氏 菌的16S rDNA序列有100%的同源性。可确定菌种为洋葱伯克霍尔德菌，命名为￥-10。
[0013] 所述微生物菌株已于2015年5月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中屯、，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号 为CGMCOfc.10843。
[0014] 在±壤重金属纯化效果评估中，主要是考察±壤可交换态重金属儒的纯化效果， 即如果±壤中可交换态儒的含量越低，则±壤中儒的纯化效果越好，植物可利用度越低。加 入本发明微生物菌株的活菌体后上壤可交换态儒在7-15d内由46.04mg/kg降到0.78mg/kg， 加入灭活菌体后±壤可交换态儒在7-15d内由46.04mg/kg降到11.09mg/kg。同时，本发明所 述菌株能够在Cd2+浓度高达300mg/L的培养基中生长，其活菌体和死菌体在水体中对低浓度 的Cd2+的去除率可分别达90%和80% W上，对高浓度的Cd2+的去除率可达40%和30% W上。 此外，加入本发明所述微生物菌株，±壤中的脱氨酶活性能够得到显著提高。
[0015] 基于上述技术效果，本发明还提出了保藏编号为CGMCC No. 10843的微生物菌株在 修复重金属污染±壤和/或制备重金属污染±壤修复剂中的应用。作为优选，所述重金属为 儒。
[0016] 在具体的应用方面，一种用于修复重金属污染±壤和提高±壤脱氨酶活性，将保 藏编号为CGMCC No. 10843的微生物菌株接种于LB液体培养基或无机盐培养基中，培养ιο? ?她 ，收集菌体加入到含有重金属的污染± 壤中， 或将菌体灭活后加入到含有重金属的污染 ±壤中，混合均匀。
[0017] 作为优选，所述LB液体培养基为0.8-1 %蛋白腺，0.5-0.8 %酵母粉，1-1.5 %氯化 钢，抑=6.8~7.0。
[001 引作为优选，所述无机盐培养基为0.1-0.2 %ΚΗ2Ρ04，0.1-0.2%Κ2ΗΡ04，0.05-0.1 % 畑4側3,0.05-0.1%]\%504,0.001-0.002%(：曰(：12,0.01-0.02%化504*7出0，抑=6.8~7.2。
[0019] 作为优选，所述微生物菌株的接种量为0.5-1%。
[0020] 同时，一种用于修复重金属污染±壤和提高±壤脱氨酶活性的制剂，包含保藏编 号为CGMCC No. 10843的微生物菌株或经过灭活的保藏编号为CGMCC No. 10843的微生物菌 株。所述微生物菌株在修复剂中的菌株数量为W0.5-1%接种量接种至LB液体培养基或无 机盐培养基中，培养10-1化的菌株数量。
[0021] 由W上技术方案可知，本发明从受重金属儒污染的±壤中筛选出一株洋葱伯克霍 尔德氏菌，其能够将±壤中的可交换态儒纯化显著降低其含量，对儒具有极强的耐受性，对 ±壤扰动小，具有较强的生物修复功能，同时能够提高±壤脱氨酶的活性，能够应用于修复 重金属污染±壤和提高±壤脱氨酶活性W及相关产品的制备中。
[0022] 生物材料保藏信息说明
[0023] W-10,分类命名：洋葱伯克霍尔德氏菌，Burldiolderia cepacia,于2015年5月22日 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、，地址为北京市朝阳区北辰西路1 号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No. 10843。
【附图说明】
[0024] 图1所示为本发明所述菌株死、活菌体对水相不同浓度重金属儒的纯化能力柱形 图；黑色柱形代表活菌体，条纹柱形代表死菌体，纵坐标表示去除率，横坐标表示儒的浓度；
[0025] 图2所示为本发明微生物菌株处理后±壤脱氨酶活性的变化折线图；其中，纵坐标 代表脱氨酶活性，横坐标代表时间。
【具体实施方式】
[0026] 本发明实施例公开了一种修复重金属污染±壤的微生物菌株及其应用。本领域技 术人员可W借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和 改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的微生物 菌株和相关应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、 精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明 技术。
[0027] 为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种修复重金属污染± 壤的微生物菌株及其应用进行详细说明。
[0028] 实施例1:本发明所述微生物菌株的筛选
[0029] 液相富集法:称取适量儒污染±壤样品加入到装有LB液体培养基的Ξ角瓶中，加 入适量玻