璃珠。将Ξ角瓶在28-30°C，150-170巧m下振荡;将±壤混合液转入离屯、管，取离屯、 后的上清液作为儒纯化微生物的来源。将上述上清液接种到含有儒的LB液体培养基中，在 28-30°C，150-170巧m下振荡培养。用无菌吸管吸取l-2mL，移入另一个富集培养Ξ角瓶中。 如此转移Ξ次后，分别在LB固体培养基和无机盐固体培养基上进行平板划线，分离单菌落。
[0030] 将上清液分别稀释1〇-1、1〇-2、1〇-3、1〇-4、1〇-5、1〇-6、1〇-7、1〇-8，吸取适量涂布于含有 50、100、200、300mg/L Cd2+的LB固体培养基上，28~30°C培养3-4d。发现在稀释1〇-4倍数情 况下易于该菌落的单独分离，可在300mg/L Cd2+浓度下正常生长，培养后取该条件下菌株划 线分离。通过上述方法，本发明筛选出一株微生物菌株。
[0031] 实施例2:本发明所述微生物菌株的鉴定
[0032] 根据天根细菌基因组DNA提取试剂盒(TIANamp bacteria DNA kit)步骤提取该菌 株的DNA用于菌种鉴定。在比对匹配度最高的结果中，菌种的所测得到的16S rDNA序列部分 与洋葱伯克霍尔德氏菌(Burldiolderia C邱acia)的16S rDNA序列有100%的同源性，可确 定菌种为洋葱伯克霍尔德氏菌(Bur化olderia C巧acia)。
[0033] 实施例3:本发明所述菌株的儒纯化特性
[0034] 将分离得到的纯培养菌株接种于LB液体培养基，28-30°C，160-170巧m下振荡培养 培养18-2化，其中一组菌体细胞先经121°C下进行灭活处理15min，然后6000-800化pm低溫 离屯、15-20min，收集死菌体，作为死细胞纯化剂；另一组菌体细胞直接3000-500化pm低溫离 屯、20-30min，收集活菌体，并用无菌水洗涂2-3次，作为活细胞纯化剂。分别将两组菌体加入 到含儒巧0-300mg/L Cd2+)水溶液中进行吸附实验，结果如图1所示。根据图1结果可W看出， 二者均对儒离子均具有较强的去除能力，但活菌体对儒的吸附能强于死菌体。
[0035] 实施例4:本发明所述菌株的死、活菌体对±壤中儒形态的影响
[0036] 将分离得到的纯培养菌株接种于LB液体培养基，28-30°C，160-170巧m下振荡培养 培养18-2化，其中一组菌体细胞先经121°C下进行灭活处理15min，然后6000-800化pm低溫 离屯、15-20min，收集死菌体，作为死细胞纯化剂；另一组菌体细胞直接3000-500化pm低溫离 屯、20-30min，收集活菌体，并用无菌水洗涂2-3次，作为活细胞纯化剂。分别将两种纯化剂加 入到含重金属儒的过筛风干±壤中，揽拌均匀，20-24°C下放置7-15d，期间保持含水量为 20-30%。纯化完成后，用BCR连续提取法提取±壤中各形态的重金属儒，步骤如下：
[0037] 1.可交换态:准确称取通过100目筛的风干±壤样品Ig，加40mL O.lmol/L的HAc， 放在恒溫振荡器中24 ± rC下连续振荡16h，然后3000-500化pm下离屯、15-20min。取上清液， 用ICP-AES测定Cd化含量。加入无菌水清洗残余物，振荡20-30min，离屯、，弃去清洗液。
[003引 2.可还原态：向1的残渣中加入40mL 0.5mol/L的盐酸径胺，放在恒溫振荡器中22- 24 °C下连续振荡15-1化，然后3000-5000巧m下离屯、15-20min。其余步骤同1。
[0039] 3.可氧化态：向2的残渣中加入lOmL肥02,揽拌均匀，室溫下静置化左右后用水浴 加热保持80-85°C化左右，再加入lOmL H202,在恒溫水浴箱中加热保持80-85°C化左右。冷 却后，加入50mL Imol/L的NH4AC，放在恒溫振动器中22-24Γ下连续震荡16h，然后3000- 5000巧m下离屯、15-20min。其余步骤同1。
[0040] 4.残渣态：向3的残渣中加入1 OmL HN03，使酸和样品充分混合均匀。进行微波消 解。重金属儒各形态的含量见表1。
[0041] 表1.经死、活菌剂处理后的±壤中重金属儒形态变化
[0042]
[0044]表1给出了经死、活菌剂处理后的±壤中重金属儒形态变化，可W看出死、活纯化 剂均能够有效地将可交换态的儒转化成为更稳定的可还原态、可氧化态和残渣态。并且，活 细胞纯化剂的效果优于死细胞纯化剂，运与水相纯化结果相一致。
[0045] 实施例5:本发明所述菌株对±壤脱氨酶活性的影响
[0046] 将分离得到的纯培养菌株接种于LB液体培养基，28-30°C，160-170巧m下振荡培养 培养18-2化，取5-lOml新鲜菌液加入到含有重金属儒的±壤中，混合均匀，监测1-10(1±壤 脱氨酶活性的变化。称取Ig经菌株处理过的儒污染±壤样品于15mL离屯、管中，向离屯、管中 加入2血0.1mol/L葡萄糖溶液和2mL 0.5%的TTC溶液，混合均匀后于37°C，100巧m条件下 避光培养16h。然后加入ImL甲醒终止反应再加入5mL丙酬，充分震荡，使附着在±壤颗粒上 的产物TPF洗脱下来。最后静置3min，使用有机滤膜过滤上清液，在485nm下测量滤液的吸光 度值，作为脱氨酶活的评价。±壤脱氨酶活性见图2。
[0047] 图2为本发明所述菌株对±壤脱氨酶活性的影响，经菌株处理后的±壤脱氨酶活 性与空白对照组相比有显著的提高，说明所述微生物菌株能够对±壤微生态起到良好的促 进作用。
[0048] W上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核屯、思想。应当指出，对 于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可W对本发明进行 若干改进和修饰，运些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
【主权项】
1. 一种修复重金属污染土壤的微生物菌株，其特征在于，保藏编号为CGMCC No. 10843。2. 保藏编号为CGMCC No. 10843的微生物菌株在修复重金属污染土壤和/或制备重金属 污染土壤修复剂中的应用。3. 根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述重金属为重金属镉。4. 保藏编号为CGMCC No. 10843的微生物菌株在提高土壤中脱氢酶活性和/或制备提高 土壤脱氢酶活性制剂中的应用。5. -种用于修复重金属污染土壤和提高土壤脱氢酶活性，其特征在于，将保藏编号为 CGMCC No. 10843的微生物菌株接种于LB液体培养基或无机盐培养基中，培养10-18h，收集 菌体加入到含有重金属的污染土壤中，或将菌体灭活后加入到含有重金属的污染土壤中， 混合均匀。6. 根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述LB液体培养基为0.8-1 %蛋白胨，0.5- 0.8% 酵母粉，1-1.5%氯化钠，pH=6.8 ~7.0。7. 根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述无机盐培养基为0.1 -0.2%KH2P〇4，0. ΙΟ · 2 % K2HPO4 ， 0 · 05-0 · 1 % NH4NO3 ， 0 · 05-0 · 1 % MgS〇4 ， 0 · 0(Π -0 · 002 % CaCl2 ， 0 · (Π -0 · 02 % FeS〇4 · 7Η20，ρΗ=6·8~7.2。8. 根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述微生物菌株的接种量为0.5 %-1 %。9. 一种用于修复重金属污染土壤和提高土壤脱氢酶活性的制剂，其特征在于，包含保 藏编号为CGMCC No. 10843的微生物菌株或经过灭活的保藏编号为CGMCC No. 10843的微生 物菌株。
【专利摘要】本发明涉及微生物领域，公开了一种修复重金属污染土壤的微生物菌株及其应用。本发明所述微生物菌株保藏编号为CGMCC？No.10843。本发明从受重金属镉污染的土壤中筛选出一株洋葱伯克霍尔德氏菌，其能够将土壤中的可交换态镉钝化显著降低其含量，对镉具有极强的耐受性，对土壤扰动小，具有较强的生物修复功能，同时能够提高土壤脱氢酶的活性，能够应用于修复重金属污染土壤和提高土壤脱氢酶活性以及相关产品的制备中。CGMCC No. 1084320150522
【IPC分类】C12R1/01, B09C1/10, C12N1/20
【公开号】CN105670980
【申请号】CN201610248561
【发明人】何声宝, 张威, 罗安娜, 刘楠, 王英元, 冯晓民
【申请人】国家烟草质量监督检验中心
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年4月20日