重组质粒pNZ8048-plnD的构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物工程技术领域，具体设及一种重组质粒pNZ8048-plnD的构建方 法。
【背景技术】
[0002] 植物乳杆菌广泛存在于人体和动物肠道内、騰制果蔬、騰制肉制品中，能利用葡萄 糖发酵代谢生产大量乳酸。除此之外，植物乳杆菌还能在胞外分泌一些具有抗菌活性的细 菌素。细菌素能被吸附在指示菌细胞膜上，引起指示菌细胞膜结构改变形成空桐，导致指示 菌胞内K+、ATP、氨基酸和憐酸盐等物质外泄而死亡。细菌素具有热稳定、无毒、高效和安全 等特点。
[0003] 植物乳杆菌ZJ316是从健康婴儿粪便中分离筛选得到的一株植物乳杆菌，对该菌 的上清发酵液过膜除菌，经排酸、过氧化物W及膜蛋白酶和蛋白酶K等酶处理之后进行抑菌 试验，试验结果表明经过一系列处理后的发酵上清仍然对指示菌具有较强的抑菌效果，并 经过全基因组测序，确认植物乳杆菌ZJ316在发酵过程中产细菌素。相比较乳酸链球菌所产 的Nisin细菌素对革兰氏阳性菌呈广谱抑菌而言，植物乳杆菌ZJ316所产的细菌素对大肠杆 菌、铜绿假单胞菌、沙口氏菌、李斯特、藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌、巧樣色葡萄球菌和副 溶血性弧菌等革兰氏阴性和阳性致病菌具有明显的抗菌作用，具有抗菌广谱性。综上所述， 植物乳杆菌ZJ316细菌素在食品、工业、农业和医药等领域具有较大的开发价值。
[0004] 植物乳杆菌ZJ316细菌素合成基因簇的5个启动子序列非常相似，具有高度保守 的-35和-10区（5'-了4〔67^41'-3'），-35区和-10区之间间隔着1269的距离，研究表明运两个 区域的间隔长度对转录效果具有很大的影响。通过对植物乳杆菌细菌素生物合成的群体感 应调节操纵子plnABCD分析，植物乳杆菌ZJ316存在群体感应调控的信号肤基因基因 plncSIF和组氨酸蛋白激膜蛋白酶基因 plnB，但是胞内缺乏调控蛋白基因 plnC和plnD，因 此，我们猜测Ξ种可能性:一是植物乳杆菌ZJ316胞内缺乏调控蛋白，群体感应信号通路中 断；二是除文献已报道的调控蛋白基因 plnC和plnD外，还存在类似调控功能的未知蛋白 Ρ1ηΧ;Ξ是植物乳杆菌ZJ316还存在另外一套细菌素生物合成群体感应调节机制。
[000引本课题针对第一种猜测，通过将克隆有调控基因的重组质粒转化至植物乳杆菌 ZJ316胞内，利用载体质粒上的信号肤强转录启动子化C8IF表达调控蛋白W弥补群体感应 调控蛋白的缺失，搭建完善群体感应调节通路，研究和探讨调控蛋白PlnC和PlnD在植物乳 杆菌ZJ316细菌素代谢合成作用调节机制。通过调控蛋白在植物乳杆菌ZJ316胞内表达可W 为植物乳杆菌ZJ316细菌素群体感应模式研究提供理论依据;为群体感应系统的开发奠定 基础;为植物乳杆菌ZJ316细菌素高产研究提供一种创新思路，在植物乳杆菌ZJ316细菌素 的开发和商业运用上也具有十分重要的意义。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种重组质粒pNZ8048-plnD的构建方法，W便更好的研究 调控蛋白PlnD对植物乳杆菌细菌素的生物代谢的调控机制。
[0007]为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
[000引本发明的重组质粒pNZ8048-plnD的构建方法，W植物乳杆菌ZJQ基因组为模板， PCR扩增plnD目的基因，将扩增得到的基因片段用PCR产物纯化试剂盒纯化特异性扩增条 带，将纯化后的PCR产物和质粒PNZ8048经化01和化nd III双酶切后纯化，16°C连接过夜，得 到重组质粒pNZ8048-plnD。
[0009] 所述PCR扩增所用引物为：
[0010] 上游引物：5 ' -CATGCCATGGCT TTGTTTCCAATTTATTTATACGA-3 ' ；
[0011] 下游引物：5 ' -CCCAAGCTTCTAGTTGTCTCTCAACAACTTAT-3 '。
[0012] 所述PCR扩增反应体系为：10Xbuffer(Mg2+)2化，2.5mmol/LdNTPMix化rel.化L， 10皿ol/L上游引物0.祉L，10皿ol/L下游引物0.祉L，DNA模板化L，rTaq DNA PolymeraseO. 2 化，其余为灭菌超纯水，总体积为20化;所述PCR扩增反应条件为:95°C预变性5min;进入循 环，95°C变性30s，49°C退火50s，72°C延伸5〇3,31个循环;反应结束后72°(3延伸1〇111111，降溫 至4°C保存。
[0013] PCR产物的双酶切反应体系为：10ΧΚ Buffer4化，plnD PCR产物30化，齡〇 I化L， Hind III化L，dd此0化L，总体积为40化;PNZ8048的双酶切反应体系为：10ΧΚ Buffer4y L，pNZ8048质粒30化，化〇 I化L，Hind III化L，d地2〇化L，总体积为40化。
[0014] 所述过夜连接的连接体系为:plnD酶切目的片段化L，酶切质粒PNZ80482化，10X T4DNA Ligase Bufferl化，T4DNAligase化L，总体积10化。
[0015] 植物乳杆菌存在群体感应效应，其中plnABCD是群体感应调控操纵子，plnCD编码 调控蛋白PlnC和PlnD。有报道表明，PlnC可能起促进转录作用，PlnD可能起抑制转录作用， 但目前关于两者究竟如何调节转录及其作用机制尚不明确。本发明构建的重组质粒 pNZ8048-PlnC和pNZ8048-PlnD，能在植物乳杆菌Z J316 (缺乏调控蛋白PlnD)中表达。该体系 有助于研究和探讨PlnC和PlnD在植物乳杆菌ZJ316中的转录调节机制，进而有助于掲示 PlnD对植物乳杆菌ZJ316细菌素合成代谢调节机制，为植物乳杆菌ZJ316群体感应模式研究 提供理论依据，也为植物乳杆菌ZJ316细菌素高产研究提供一种创新思路，在植物乳杆菌 ZJ316细菌素的开发和商业运用上也具有十分重要的意义。同时，该体系也适用于研究PlnD 对除ZJ316外的其他植物乳杆菌细菌素合成调节机制，为植物乳杆菌群体感应系统的开发 奠定基础。
[0016] 本发明中设及的植物乳杆菌ZJQ已于2013年03月29日在中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中屯、进行保藏，分类命名：植物乳杆菌，拉下文学名Lactobacillus plantarum，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、，保藏单位简称 CGMCC，保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2013年03月29日，保藏 编号7391。
【附图说明】
[0017] 图1植物乳杆菌ZJQ基因组;注:Μ: Marker，上样量3化;Li-L2 :植物乳杆菌ZJQ基因 组，上样量化L。
[0018] 图2 PCR扩增P InC目的基因；注:Μ: Marker，上样量^-L9 :植物乳杆菌ZJQ号 plnC基因 PCR基因电泳条带，上样量化L bo:不加 DM模板的阴性对照，上样量化L。
[0019] 图3 PCR扩增plnD目的基因进:Μ:Marker，上样量3化山-L9:植物乳杆菌9号plnD 基因 PCR基因电泳条带，Li-Ls，上样量化L，L9 :上样量扣レbo:不加 DM模板的阴性对照，上样 量!5化。
[0020] 图4 PNZ8048质粒粘性末端片段的获取；注：M:Marker，上样量^L^:Nco I和 Hind III双酶切后的DNA片段，上样量化LL2:Nco I单酶切后的片段，上样量化LL3:Hind III单酶切后的片段，上样量化L Ls: PNZ8048环状质粒，上样量扣L。
[0021 ]图5目的基因片段粘性末端片段的获取；注：M:Marker，上样量^L^:Nco I和 Hind III双酶切后的plnC片段，上样量化LL2:Nco I和化nd III双酶切后的plnD片段，上 样量化L。
[0022] 图6重组质粒pNZ8048-plnD图谱;将酶切后的PNZ8048质粒和plnDPCR片段进行连 接，后转化大肠杆菌，并将其涂布在含有30yg/mL氯霉素的LB固体培养基上，37°C培养箱中 培养16-18小时。图中为获得的重组质粒pNZ8048-plnD图谱。
[0023] 图7转化子E.coli MC1061 (pNZ8048-plnD)的鉴定；注:M:Marker，U-L日：plnD片段 的菌