目的片段双酶切
[0141] 如图4所示，1号泳道为Nco I和化nd III双酶切后片段，2号泳道为化0 I单酶切后 片段，3号泳道为化nd III单酶切后片段，4号泳道为PNZ8048环状质粒。酶切开后的线性质 粒条带明显大于未酶切的环状质粒，运是因为超螺旋质粒切开后会变成开链线性DNA链，开 链的DNA在琼脂糖凝胶电泳中泳动的空间阻力大，速度慢于超螺旋质粒，PNZ8048质粒大小 为3349bp，因此环状质粒未酶切小于3349bp，酶切后的条带大小在3349bp左右。由于Nco I 和化nd III双酶切切下的小片段小于lOObp难W看到切下的小片段，双酶切大片段质粒与 单酶切质粒的位置区别不大。
[0142] 如图5所示，1号泳道为plnC目的基因 PCR产物化0巧日化nd III双酶切后割胶回收 的特异性明亮条带。2号泳道为plnD目的基因 PCR产物Nco I和化nd III双酶切后割胶回收 的特异性条带。plnC和plnD目的条带的长度均为744bp，由于化0 I和化nd III双酶切切下 的小片段小于Ubp，在图上难W看到小片段条带。
[0143] 3.4阳性转化子的筛选
[0144] 3.4.1单菌落的挑取
[0145] 植物乳杆菌表达质粒PNZ8048上具有抗氯霉素基因，能编码氯霉素乙酷转移酶 (畑loramphenicol Acetyl transferase , CAT)，该酶能使氯霉素失活，因此只有胞内有 PNZ8048质粒拷贝的大肠杆菌E.coli MC1061能在含氯霉素的培养基中存活下来。酶切后的 质粒和PCR片段经连接后转化大肠杆菌，并将其涂布在含有30yg/mL氯霉素的LB固体培养基 上，37°C培养箱中培养16-18小时。如图6所示，A为重组质粒pNZ8048-plnC热击转化后涂布 的平板;B为重组质粒pNZ8048-plnD热击转化后涂布的平板;C为E.coli MC1061感受态做的 对照热击后涂布的平板。
[0146] 3.4.2菌液?0?验证
[0147] 挑取单菌落接种至含有lOmL LB液体培养基(含30yg/mL氯霉素）的试管中扩大培 养。从各试管中各取化L菌液，W化L菌液为DNA模板进行菌液PCR验证。菌液PCR结果如图7所 示，A为E.coli MC1061(pNZ8048-plnC)菌液PCR，泳道1、2、3均出现特异性条带，条带位置与 plnC目的基因片段744bp位置相符合，泳道1特异性条带较泳道2,3条带亮，提取泳道1的试 管中大肠杆菌的质粒送生工测序;B为E.coli MC1061(pNZ8048-plnD)菌液PCR，泳道2出现 特异性明亮条带，条带位置与plnD目的基因片段744bp位置相符合提取泳道2的试管中大肠 杆菌的质粒送生工测序。
[014引 3.5重组载体测序及序列比对
[0149] 3.5.1重组载体测序
[0150] 测序用的引物是plnD-Sense和plnD-Anti-sense引物，送生工双向测序，测序结果 进行拼接。plnD序列长744bp，测序结果plnD中含247A，占比例33.2%;114C，占15.3% ; 164G，占比例22.0% ;219T，占比例29.4%，下划线部分为相应的酶切位点。
[0151] 3.5.2序列比对
[0152] 经Blast比对显示，（pNZ8048-plnD)中的plnD基因，与植物乳杆菌ZJQ中的和plnD 基因相似度为100%，表明本实验的大肠杆菌重组子构建成功。plnD属于植物乳杆菌的调控 细菌素合成的调控蛋白。在植物乳杆菌ZJQ中，plnD基因和植物乳杆菌ST-III和WCFS1同源 相似度100 %，与植物乳杆菌B21和C11有一个碱基不一样，相似度99.87 %，翻译成氨基酸序 列同源相似度100 %。
[0153] 3.^)NZ8048-plnD在植物乳杆菌ZJ316中转录研究
[0154] 表6 pNZ8048-plnD在植物乳杆菌ZJ316中转录结果
[0155]
[0156] 将重组质粒pNZ8048-plnD及空载质粒PNZ8048分别电击转化植物乳杆菌 L. planta;rumZJ316，获得重组菌株 L. plan1:a;rumZJ3l6-D 和对照菌株 L. planta;rumZJ316-P。 通过Real-time qPCR技术，定量分析重组L.planta;rumZJ316-D菌株中plnD转录的mRNA拷贝 数，进而确定调控基因 plnD的转录水平，WL.planta;rumZJ316-P的中plnD转录水平为对照。 结果表明，L. P lantarumZ J316-D菌株中P InD大量转录，转录结果见表6。
【主权项】
1. 一种重组质粒pNZ8048-plnD的构建方法，其特征在于以植物乳杆菌ZJQ基因组为模 板，PCR扩增plnD目的基因，将扩增得到的基因片段用PCR产物纯化试剂盒纯化特异性扩增 条带，将纯化后的PCR产物和质粒pNZ8048经Ncol和Hind III双酶切后纯化，16°C连接过夜， 得到重组质粒pNZ8048-plnD。2. 根据权利要求1所述的重组质粒pNZ8048-plnD的构建方法，其特征在于:所述PCR扩 增所用引物为： 上游引物：5 ' - CATGCCATGGCT TTGTTTCCAATTTATTTATACGA-3 ' ； 下游引物：5 ' - CCCAAGCTTCTAGTTGTCTCTCAACAACTTAT-3 '。3. 根据权利要求1所述的重组质粒pNZ8048-plnD的构建方法，其特征在于:所述PCR扩 增反应体系为：10 Xbuffer (Mg2+)2yL，2.5 mmol/L dNTP Mixturel ·6yL，10 ymol/L上游 引物0.8yL，10 ymol/L下游引物0.8yL，DNA模板lyL，rTaq DNA Polymerase0.2yL，其余为灭 菌超纯水，总体积为20yL;所述PCR扩增反应条件为:95°C预变性5min;进入循环，95°C变性 30s，49°C退火50s，72°C延伸50s，31个循环;反应结束后72°C延伸lOmin，降温至4°C保存。4. 根据权利要求1所述的重组质粒pNZ8048-plnD的构建方法，其特征在于:PCR产物的 双酶切反应体系为：l〇XK Buffer4yL，plnD PCR产物30yL，Nco I 2yL，Hind III 2yL， ddH20 2yL，总体积为40yL;pNZ8048的双酶切反应体系为：10XK Buffer4yL，pNZ8048质粒 30yL，Nco I 2yL，Hind III 2yL，ddH20 2yL，总体积为40yL。5. 根据权利要求1所述的重组质粒pNZ8048-plnD的构建方法，其特征在于:所述过夜连 接的连接体系为4111〇酶切目的片段6以1^，酶切质粒？似80482以1^，10\了40麻1^8 &86 Buff erlyL，T4DNAl igaselyL，总体积 10yL。
【专利摘要】本发明公开一种重组质粒pNZ8048-plnD的构建方法，以植物乳杆菌ZJQ基因组为模板，PCR扩增<i>pln</i>D目的基因，将扩增得到的基因片段用PCR产物纯化试剂盒纯化特异性扩增条带，将纯化后的PCR产物和质粒pNZ8048经<i>Nco</i>I和<i>Hind</i>？III双酶切后纯化，16℃连接过夜，得到重组质粒pNZ8048-plnD。本发明构建的重组质粒pNZ8048-PlnD，能在植物乳杆菌ZJ316（缺乏调控蛋白PlnC和PlnD）中表达。该体系有助于研究和探讨PlnC在植物乳杆菌ZJ316中的转录调节机制，进而有助于揭示PlnD对植物乳杆菌ZJ316细菌素合成代谢调节机制，为植物乳杆菌ZJ316群体感应模式研究提供理论依据，也为植物乳杆菌ZJ316细菌素高产研究提供一种创新思路，在植物乳杆菌ZJ316细菌素的开发和商业运用上也具有十分重要的意义。CGMCC No.739120130329
【IPC分类】C12N15/66
【公开号】CN105505965
【申请号】CN201510776933
【发明人】顾青, 郦萍, 王小丰
【申请人】浙江工商大学
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年11月12日