专利名称：乙型肝炎病毒分离株复制型质粒的构建方法
技术领域：
本发明涉及乙型肝炎病毒的体外表型研究技术领域，具体涉及乙型肝炎病毒分离 株复制型质粒的构建。
背景技术：
在我国乙型肝炎病毒(HBV)感染是导致慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌的主要原 因。HBV复制是通过逆转录过程来实现，在此过程中最易发生变异。近年来，随着抗病毒 药物和疫苗的应用推广，由于病毒变异而出现的耐药和免疫逃逸问题越来越引起人们的重 视。对HBV变异株的临床分离株进行表型研究是HBV变异研究的重要手段。HBV变异株的体外表型研究以细胞模型应用的最为广泛。细胞模型研究方法又包 括载体介导和非载体介导的短暂细胞转染和稳定转染细胞系的构建，其中非载体介导的短 暂细胞转染虽然具有方便、快速的优点，但转染后HBV复制效率较低，难以在试验室广泛应 用。载体介导的短暂细胞转染和稳定转染细胞株在当今的HBV表型研究中较为多见，其中 HBV可复制型质粒的构建是上述两种方法的基础。目前国内外应用较多的HBV复制型质粒 多为来源于法国和美国试验室的1. I-HBV的载体，但是在载体上启动转录的元件都是外源 启动子和POLYA信号，具有一定的局限性(1)外源元件对于HBV复制和表达的影响不清 楚；(2)HBV的启动子并不是严格的保守区域，临床常见的1762和1764位的变异就发生在 启动子区，1. I-HBV的载体无法对以上区域的变异进行表型研究。并且国内已有的复制型质 粒其HBV病毒株多来源于国外标本，其血清型和基因型和国内病毒株有较大差别。因此，利 用来源于中国的临床标本中构建HBV复制性质粒在当今有着重要的应用价值。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种具有病毒自身遗传学特性的HBV复制型质 粒的构建方法，具有高效率、高稳定性的特点。为实现上述发明目的，本发明公开如下技术方案一种乙型肝炎病毒分离株复制型质粒的构建方法，包括(I)HBV全长基因组的抽 提、PCR扩增和克隆构建；(2)重组过渡载体的构建；(3)重组过渡载体的酶切与去磷酸化； (4)复制型质粒的构建，所述重组过渡载体由三个连接片段同时定向连接，两个插入的HBV 片段之间形成两个反向的BspQI酶切位点，使用SOC培养基进行HBV全长基因组克隆和复 制型质粒的菌落培养扩增。所述重组过渡载体包含HBV完整的EnhI、EnhII、复制和转录起始点，重组过渡载 体去磷酸化后进行一次自身连接和转化。步骤(1)中PCR产物纯化后经末端加A，将全长基因组片段插入T0P0XLPCR载体； 步骤(3)中重组过渡载体的酶切使用BspQI内切酶。本发明具有以下有益效果(1)目前HBV全长基因组克隆技术存在着克隆构建效率低下和插入的基因组片段不稳定的问题，本发明采用了 T0P0XLPCR克隆构建技术，使用了可容纳> 3kb的长片段插入 的XL-TOPO载体，提高了克隆构建效率。(2)关键酶的酶切效率提高。现有技术中SapI内切酶的使用是所有HBV克隆构 建试验技术的关键，但这种内切酶酶切效率低下，易受外界反应条件干扰，是目前克隆构建 技术中难以突破的瓶颈问题。本发明以BspQI内切酶代替SapI内切酶，成功解决了上述问 题，极大提高了试验进程。(3)目前尚没把SOC培养基应用于质粒扩增的记录，以高营养的SOC培养基取代传 统的LB培养基进行菌落培养扩增，保证了质粒在扩增过程中的稳定性。(4)重组过渡载体包含了 HBV完整的EnhI、EnhII、复制和转录起始点，增加了病毒 的复制效率。(5)重组过渡载体去磷酸化后进行一次自身连接和转化，以保证去磷酸化效率。本发明在技术上具有操作方法简捷，克隆构建效率高，结果稳定，由于采用了 HBV 自身复制转录起始点和调控元件，产生的HBV复制型质粒具有病毒自身的遗传学特性，可 代表病毒自身的转录复制特性，并且可对中国的HBV临床分离株进行全面综合的全基因组 表型研究。
下面结合说明书附图，对本发明进一步详细说明。图1 两段PCR扩增区域示意图。图2 过渡载体插入片段示意图。图3 :HBV全长基因组插入过渡载体示意图。
具体实施例方式实施例1(I)HBV全长基因组的抽提、PCR扩增和克隆构建。采用病毒基因组抽提试剂盒提 取HBV DNA, PCR扩增全长基因组，在扩增引物中同时加入BspQI和XbaI两个酶切位点，引 物如下PlFULL=CCGG TCTAGA GCTCTTC tttttcacctctgcctaatcaP2FULL=CCGG TCTAGA GCTCTTC aaaaagttgcatggtgctgg反应体系为10XPCR buffer5μ 1dNTP mix (IOmM)1 μ 1引物1(25ρΜ)Ιμ 引物 2(25ρΜ)1 μ 1Pfu 酶(2U/ μ 1)1 μ 1HBVDNA10 μ 1加ddH20 至50 μ 1反应体系 95°C 5min，95°C 40s — 58°C 30s — 72°C 180s，循环 35 次，最后 72°C保 温 IOmin。
产物经凝胶电泳后取3. 2kb条带纯化，以Taq酶+dATP 72°C反应15分钟，末端加 A后将与T0P0XLPCR载体混勻室温反应5分钟，转化后菌落PCR及测序鉴定。(2)重组过渡载体的构建重组过渡载体引物如下P3 =CCGG GAATTC ACAGAGCTGAGGCGGTGTCGP5 =CAGA CTGCAG GTCTTTTGGG(C/G)TTTGC(T/C)GCCCCPlFULL 和 P2FULL 见前以前面构建的HBV全长基因组克隆为模板，分别以P1FULL/P3和P2FULL/P5引 物对进行PCR扩增，产物分别为包含HBV完整的Enhl、EnhII、复制和转录起始点在内的 1000nt-1820nt片段和包含了 POLYA序列的1820nt_2000nt区域(图1)。两段扩增产物纯 化后分别以EcoRI/Xbal和Pstl/Xbal酶切，并以EcoRI/PstI酶切pSP65载体，三段酶切产 物纯化后同时进行连接反应，由于各个片段具有各自特异的酶切位点，连接产物将形成定 向连接的重组过渡载体，转化感受态细胞后以测序鉴定，在此过渡载体中，两个插入的HBV 片段之间将会形成两个反向的BspQI酶切位点(图2)。(3)重组过渡载体的酶切与去磷酸化采用BspQI内切酶对过渡载体酶切，反应条 件为载体 1 μ g，BspQI 1μ Ι,ΙΟΧ buffer 2μ 1，Η20 补充至 20μ 1。50°C水浴 1 小时。电 泳后凝胶纯化，酶切产物以碱性磷酸酶进行去磷酸化反应1小时，取5 μ 1纯化产物以T4DNA 连接酶进行自身环化连接并转化，以检测去磷酸化效率。当转化菌落生长小于10个/平板 时表明去磷酸化成功。(4)复制型质粒的构建利用BspQI酶切重组HBV全长基因组TOPO质粒，反应 条件如前所述，凝胶电泳后切取3. 2kb条带，纯化后将HBV全长基因组连接入步骤3处理 后的重组过渡载体(图3)，以SOC培养基进行菌落培养和扩增，SOC培养基配方如下2% Tryptone, 0. 5% Yeast Extract, 0. 05% NaCl, 2. 5mM KCl, IOmM MgC12，20mM 葡萄糖。
权利要求
一种乙型肝炎病毒分离株复制型质粒的构建方法，包括(1)HBV全长基因组的抽提、PCR扩增和克隆构建；(2)重组过渡载体的构建；(3)重组过渡载体的酶切与去磷酸化；(4)复制型质粒的构建，其特征在于所述重组过渡载体由三个连接片段同时定向连接，两个插入的HBV片段之间形成两个反向的BspQI酶切位点，使用SOC培养基进行HBV全长基因组克隆和复制型质粒的菌落培养扩增。
2.根据权利要求1所述的一种乙型肝炎病毒分离株复制型质粒的构建方法，其特征在 于所述重组过渡载体包含HBV完整的EnhI、EnhII、复制和转录起始点。
3.根据权利要求1或2所述的一种乙型肝炎病毒分离株复制型质粒的构建方法，其特 征在于重组过渡载体去磷酸化后进行一次自身连接和转化。
4.根据权利要求1所述的一种乙型肝炎病毒分离株复制型质粒的构建方法，其特征在 于步骤(1)中PCR产物纯化后经末端加A，将全长基因组片段插入T0P0XLPCR载体。
5.根据权利要求1所述的一种乙型肝炎病毒分离株复制型质粒的构建方法，其特征在 于步骤(3)中重组过渡载体的酶切使用BspQI内切酶。
全文摘要
本发明公开了一种乙型肝炎病毒分离株复制型质粒的构建方法，包括(1)HBV全长基因组的抽提、PCR扩增和克隆构建；(2)重组过渡载体的构建；(3)重组过渡载体的酶切与去磷酸化；(4)复制型质粒的构建，所述重组过渡载体由三个连接片段同时定向连接，两个插入的HBV片段之间形成两个反向的BspQI酶切位点，使用SOC培养基进行HBV全长基因组克隆和复制型质粒的菌落培养扩增。本发明应用了新型的全长基因组克隆载体、改进了酶切方案以及采用了新型菌落培养基。具有方法简捷，高效稳定的优点，可对中国的HBV临床分离株全基因组进行全面综合的表型研究，具有重要的应用价值。
文档编号C12N15/85GK101993893SQ20091005645
公开日2011年3月30日 申请日期2009年8月14日 优先权日2009年8月14日
发明者于德敏, 姜节洪, 张东华, 张欣欣, 邓俊, 陈立 申请人:上海交通大学医学院附属瑞金医院