一种节杆菌表达质粒与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学与生物工程技术领域，具体涉及一种节杆菌表达质粒，及 该质粒的构建方法与应用。
【背景技术】
[0002] 节杆菌是一种在土壤中分布广泛的专性好氧微生物，在系统分类学上属于放线菌 微球菌科（Micrococcaceae)。节杆菌细胞在生长过程中会产生显著的形态变化，早期培养 物中的细胞呈不规则细杆状，部分杆菌按照一定的角度排列，进入稳定期后细胞呈球形，将 其转接到新鲜的培养基中，细胞又会产生分支，形成不规则的杆状，如此循环是节杆菌最典 型的形态特征。节杆菌既可以生存在与普通的土壤中，也可以生存在各种条件复杂的极端 环境中，如有机溶剂、极寒地区，近些年的研究表明节杆菌除了具有以上抗逆性以外还能用 于生产氨基酸和生物表面活性剂。因此，节杆菌具有重要的研究和工业应用价值。
[0003] 但是，目前节杆菌可用的表达质粒很少，从而限制了节杆菌的基因研究和工业应 用。目前已经报道的节杆菌质粒主要有如下几个：1988年Shaw等利用来源于谷氨酸棒杆菌 的复制原点PBL100,以pULRS8为骨架构建了一种隐蔽质粒。2005年Sandu等利用来源于谷 氨酸棒杆菌的复制原点PCG100构建了pART2和pART3两种质粒。其中pART2可以用于基因 的组成型表达，PART3可以用尼古丁诱导基因表达。以上所报道大肠杆菌-节杆菌穿梭质粒 都是利用系统发育相近物种的隐蔽质粒构建的。2008年Miteva等报道了以节杆菌隐蔽质 粒p54 为骨架的杂交载体（hybridvector)pSVJ21。2011 年Ruta等报道了以Arthrobacter rhombi隐蔽质粒pPRH为复制子来源的E.coli-Arthrobacter穿梭质粒Prmu824Km。上述 几种质粒，只有PART2和pART3可以用于在节杆菌中表达基因，其他的质粒仅限于用于研究 质粒在节杆菌中的拷贝数及节杆菌的电转化实验。
【发明内容】
[0004] 本发明需要解决的技术问题是：提供一种新型的节杆菌表达质粒。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
[0006] 一种节杆菌表达质粒，该质粒为环状，该质粒包含SEQIDN0:1中第152bp~ 261bp所示的核苷酸序列，该核苷酸序列具有启动子功能。
[0007] 上述质粒作为基因载体在原核生物中的应用在本发明的保护范围之内。
[0008] 作为优选，将上述质粒作为基因载体在节杆菌中表达基因。
[0009] 一种节杆菌表达质粒，该质粒包含SEQIDN0:1中第572bp~1976bp所示的核苷 酸序列，该核苷酸序列具有起始质粒复制的作用。
[0010] 上述质粒作为基因载体在原核生物中的应用在本发明的保护范围之内。
[0011] 作为优选，将上述质粒作为基因载体在节杆菌中表达基因。
[0012] 一种节杆菌表达质粒，该质粒的核苷酸序列如SEQIDN0:1所示。
[0013] 上述质粒作为基因载体在原核生物中的应用在本发明的保护范围之内。
[0014] 作为优选，将权利要求7所述的质粒作为基因载体在节杆菌中表达基因。
[0015] 有益效果：
[0016] 1、本发明提供了一种新型的节杆菌表达质粒，提供了一种新型的节杆菌启动子和 节杆菌中的复制子。
[0017] 2、利用该节杆菌表达质粒表达绿色荧光蛋白基因，利用荧光显微镜能观察到明显 的绿色荧光，说明gfp基因得到了表达。
[0018] 3、利用本发明提供的质粒在节杆菌CGMCC3584中表达hgprt基因，其cAMP产量达 到了 7. 80g/L，比出发菌株提高了 65. 2%。
【附图说明】
[0019] 图1 pA3质粒图。
[0020] 图2 0RF1比对结果。
[0021] 图 3pUAK3 质粒构建电泳图；M1:DL5000markerM2:DL2000marker1:MCS序列 部分 2 :REP1 3:kan基因 4 :pUC18。
[0022] 图 4pUAK3 质粒图。
[0023]图 5pUAK4 质粒构建电泳图；M1:DL5000markerM2:DL2000marker1:MCS序列 部分 3:kan基因 4 :pUC18 2 :REP2。
[0024]图 6pUAK4 质粒图。
[0025] 图 7pUAKP质粒构建电泳图；Ml :DL 2000marker M2 :DL 10000 marker 1 :P13-3 启动子片段酶切回收2 :pUAK4酶切回收3 :pUAKP质粒酶切验证。
[0026]图 8 pUAKP质粒图。
[0027]图 9 pUAKP-GFP质粒图。
[0028] 图10荧光显微镜观察结果图。
[0029] 图11节杆菌空菌、pAK-Arth、pUK-Arth发酵结果比较；1:节杆菌空菌2: pAK-Arth3 :pUK-Arth。
【具体实施方式】
[0030] 根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本 发明。
[0031] 实施例1:节杆菌复制子的获取。
[0032] 通过在GenBank中检索节杆菌的天然质粒，发现pA3质粒（GenBank登记号为 AJ131246. 1)的全长为2205bp，含有5个0RF(如图1所示）全序列。为研究该质粒的复制 子，将PA3质粒的基因序列交由苏州金唯智生物技术有限公司合成进行全基因合成。
[0033] 口43大小为2205&口，其核苷酸序列如3￡〇10勵：2所示，6+(：含量为59.86%，含有 5个0RF，每一个0RF的。将GenBank中标注的5个0RF编码的氨基酸序列在NCBI中BLAST， 比对结果见表1所示，结果表明0RF1氨基酸序列与Propionibacteriumacnes的复制起始 因子有30%相似性（见图2)说明0RF1最可能就是pA3的复制起始因子但是其余0RF的氨 基酸序列在NCBI中没有找到相似的基因序列，无法确定其余各0RF的功能。
[0034]表lpA3质粒0RF功能预测
[0036] 根据启动子预测结果和BLAST结果，确定0RF1可能是pA3质粒的复制起始位点， 于是将0RF1连同其上游150bp-起克隆下来，记为REP1，通过一步克隆的方法将REP1、卡 那霉素抗性基因克隆到PUC18质粒上得到pUAK3质粒，其基因PCR结果见图3。
[0037]pUAK3质粒的构建方法如下：以pUC18为模板，Pucl8_F和Pucl8_R为引物对扩增 得到pUC18-p序列；以pART2质粒为模板，MCS-F和MCS-R为引物对扩增得到MCS序列；以 pUC57-pA3质粒（克隆有pA3质粒的pUC57质粒）为模板，REP-F1和REP-R为引物对扩增 得到REP-1，以pART2为模板；Kan-F和Kan-R为引物对，PCR得到Kan片段。按照表2所示 的PCR反应体系扩增各个片段。上述各引物序列如表3所示。
[0038] 表2PCR反应体系
[0040]表3引物设计序列
[0041]
[0042] 将得到的PCR片段通过切胶回收，以凝胶成像系统带