一种水稻花粉强特异表达启动子OsPoll3及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术和作物基因工程技术领域。具体而言，本发明设及一种水稻 花粉强特异表达启动子及其应用，该启动子能够在作物基因工程中驱动目标基因在花粉中 特异表达，从而创造雄性不育材料，或者进行基因剔除，防止外源基因通过花粉污染其他非 转基因（作物)植物，提高转基因作物的生物安全性。
【背景技术】
[0002] 水稻是我国乃至全世界最主要的食品来源之一，我国目前有一半W上的人口 W稻 米为主食，人均摄入热量的30%、蛋白质的19%均来源于稻米。随着人民生活水平的提高， 稻米在粮食作物中的比重将持续增长。水稻在保障我国粮食安全中担当重要角色，杂交育 种对于提高水稻产量非常重要。水稻杂交育种常用=系法及两系法，运些方法利用的是花 粉特异性发育性状。
[0003] 目前水稻S系法制种主要利用核一质互作雄性不育系、保持系和恢复系实现S系 配套实现杂交育种，运种方法不仅种子生产程序比较复杂，选育新组合的周期长，制种成本 高，而且种质资源利用有限，在一定程度上限制了杂交水稻产量的进一步提高。而现在广泛 使用的两系法制种体系即光溫敏不育系实现了一系两用，简化了繁殖不育系的技术环节。 但光溫敏核不育系容易受光周期和溫度变化的影响，育性不稳定，影响制种纯度，具有一定 的制种风险，特别是当前全球气候异常影响了水稻光溫敏不育系的推广和利用。因此，培育 不受环境影响且可W自主繁殖的稳定不育系已成为两系杂交技术广泛应用的技术瓶颈。
[0004] 水稻中广泛存在的核雄性不育材料，不育性遗传性状稳定，受外界环境条件影响 小，在杂交育种和农业生产上都具有十分重要的意义。花粉特异启动子被广泛用于创造核 雄性不育植物。而具有强特异性的启动子往往是可遇而不可求的，目前还没有任何一种方 式能够根据需求来构建或直接筛选出相应启动子序列。目前发现的花粉特异启动子有烟草 花特异启动子TA29，番茄花粉特异启动子Ia巧2，水稻花粉特异RASgene启动子、玉米ZmC5基 因启动子、ZM13启动子等等，花粉特异启动子-barnase (RNase)载体已经用来转化烟草、油 菜、水稻、玉米等，通过基因工程获得雄性不育系。
[0005] 但是，仅仅上面几种可用的花粉启动子在生产和研究过程中是远远不够的。因此， 本发明希望能够再找到一种在花粉中具有强特异性表达性状的启动子。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种驱动外源基因在水稻花粉强特异表达的启动子、获得含 有该启动子序列的转化子W及该启动子的应用。其中，本文中所设及的"作物"是指禾本科 作物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高梁或燕麦，优选为水稻。
[0007] 为了实现上述目的，一方面，本发明提供一种水稻花粉特异表达启动子，所述水稻 花粉特异表达启动子包含：
[000引（a)序列表中SEQ ID NO: 1中所示的核巧酸序列;或者
[0009] (b)序列表中SEQ ID NO:2中所示的核巧酸序列;或者
[0010] (C)在序列表中SEQ ID NO: 1中所示的核巧酸序列中添加、取代或缺失一个或多个 核巧酸后所获得的核巧酸序列;或者
[0011] (d)在序列表中SEQ ID N0:2中所示的核巧酸序列中添加、取代或缺失一个或多个 核巧酸后所获得的核巧酸序列;或者
[0012] (e)与序列表中SEQ ID NO: 1中所示的核巧酸序列互补的核巧酸序列;或者
[0013] (f)与序列表中SEQ ID N0:2中所示的核巧酸序列互补的核巧酸序列;或者
[0014] (g)与序列表中SEQ ID NO: 1中所示的核巧酸序列具有至少90%同源性的核巧酸 序列;或者
[001引化)与序列表中SEQ ID N0:2中所示的核巧酸序列具有至少90%同源性的核巧酸 序列。
[0016]本领域技术人员可W预期，上述(C)-化）中的水稻花粉强特异表达启动子序列与 序列表中SEQ ID No: 1或2所示序列具有相同功能，即驱动目标基因在作物花粉中特异表达 功能的序列，因此，其也包含在本发明的范围内。序列表中SEQ ID No:l或2所示的DNA序列 为来源于日本晴水稻（Oirza sativa L CV.Ni卵onbare)的序列，本文中称为Os化113或启 动子Os化113。具体而言，本申请的发明人从日本晴水稻（Oryza sativa L CV.化卵onbare) 中分离克隆得到了序列表中SEQ ID No: 1和2中所示的DNA序列，并且发现该DNA序列具有驱 动目标基因在水稻花粉强特异表达的作用。
[0017] 需要说明的是，在序列表中，SEQ ID No: 1中所示的DNA序列与SEQ ID No:2所示的 启动子的区别主要在于SEQ ID No: 1中所示的DNA序列在开头部分多了 "Ctgatgtggt c1:aaccccga gt"共计22bp，在结尾部分多了 "gtgaagac cctgacgggg aaga"共计22bp，运两 部分为获得启动子过程中使用的引物的留存序列或其互补序列。而SEQ ID No:2所示的DNA 序列为纯获自日本晴水稻中的DNA序列。需要强调的是，本文中所提到的启动子既可W指 SEQ ID No:l，也可W指SEQ ID No:2,二者可W发挥相同的作用。即便本领域技术人员在本 发明的基础上，采用其他引物获得了类似序列，其也落入本发明的保护范围之内。
[0018] 优选地，本发明提供的水稻花粉强特异表达启动子的DNA序列由序列表中SEQ ID No: 1或2所示的序列，即OsPo 113或启动子Os化113构成。
[0019] 另一方面，本发明还提供一种包含上述水稻花粉强特异表达启动子的表达盒。
[0020] 又一方面，本发明还提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含上述的水稻 花粉强特异表达启动子，在所述重组表达载体中，所述水稻花粉强特异表达启动子连接于 待表达的基因序列的上游；优选地，所述待表达的基因为Gus基因，所述重组表达载体为 pCAMBIA1391-〇sPoll3,该重组表达载体为将沈Q ID No:l所示的序列即Os化113或启动子 0sPoll3构建于PCAMBIA1391中得到的重组表达载体，本文中称为pCAMBIA1391-〇sPoll3。
[0021] 或者待表达基因可W为任何对作物的花粉性状具有改善能力的基因。通过本发明 的启动子驱动该基因在花粉中强特异性地集中表达，从而实现改善水稻花粉相应性状的功 能。
[0022] 再一方面，本发明提供上述水稻花粉强特异表达启动子在培育转基因作物中的应 用。所述应用包括将本发明提供的上述水稻花粉特异表达启动子连接于载体的待表达的基 因序列上游(例如，将所述启动子序列置于/插入目标基因之前），从而构建重组表达载体， 将所述重组表达载体转化到作物细胞、组织或器官中进行培育。
[0023] 并且优选地，所述应用可W用于改良作物生长特性，所述作物为禾本科作物，例如 水稻、小麦、玉米、大麦、高梁或燕麦，优选为水稻。
[0024] 更优选地，所述应用包括：
[0025] 利用序列表SEQ ID No.3和4中的引物，W水稻品种日本晴DNA为模板，扩增所述的 水稻花粉强特异表达启动子Os化113;
[0026] 回收目的片段，将其连接到预定载体上，按照热激法转化大肠杆菌感受态细胞后， 使感受态细胞激活，进而将目的片段转入到激活的感受态细胞中，然后，经菌落PCR筛选获 得阳性克隆，挑取单克隆摇菌液提质粒，用SaU和EcoRI进行双酶切验证，验证正确的克隆 即为所要获得的水稻花粉强特异表达启动子Os化113;
[0027] 从上面获得的阳性克隆中提取质粒，用Sail和Eco