Pik3r2在猪卵巢颗粒细胞中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于细胞工程和基因工程技术领域，具体设及一种PIK3R2在猪卵巢颗粒细 胞的应用。
【背景技术】
[0002] 在商品猪肉生产中，母猪的利用年限直接关系到猪场的经济效益。影响母猪利用 年限的因素主要有繁殖障碍、自然环境、品种、营养等，其中繁殖障碍是导致母猪过早从猪 群中淘汰的最主要原因之一。在母猪繁殖障碍中卵巢的疾病是一个重要诱因。
[0003] 卵巢是哺乳动物重要的生殖腺，是卵泡发育和排卵的重要繁殖器官。卵泡作为卵 巢的基本组成单位，维持着卵子的存在、发育与闭锁。颗粒细胞是卵泡周围扁平或立方状细 胞，其生长与分化在卵泡的发育过程中起着重要的调控作用。雌性哺乳卵巢中仅有少数卵 泡能够发育成熟并排卵，而绝大部分卵泡在发育的各个阶段发生闭锁退化，其重要且直接 原因来自于颗粒细胞的调亡。颗粒细胞的调亡是启动卵泡闭锁的重要机制。
[0004] 憐脂酷肌醇3激酶(PI3K)是一种脂类激酶的憐酸化憐脂酷肌醇及类似化合物，它 作为第二信使在生长信号通路中具有重要作用。PIK3R2(p850)是PI3K调节亚基p85之一，能 够产生3-多憐酸肌醇。PI3KR2能够提高细胞胞膜上的PIP3(S憐酸肌醇），是PI3K/Akt信号 通路负性调控因子，众多研究表明PI3K/Akt信号通路与卵泡的发育有着密切的联系。
[0005] MicroRNAs(miRNAs)是在真核生物中发现的一类内源的具有调控功能的非编码 RNA，其大小长约20~25个核巧酸。它主要通过与祀基因 mRNA的y端非翻译区化TR)完全或 不完全配对而降解祀mRNA或抑制mRNA的正常翻译，进而对基因转录后表达进行调控。近年 来，关于哺乳动物卵巢发育的miRNA调控也受到研究者关注，多项研究表明miRNA广泛参与 卵子发生、卵泡发育、闭锁和黄体形成、退化等多个生物学过程。miRNA还参与一些卵巢疾病 的调控，主要有卵巢癌和卵巢早衰。
[0006] 该技术现在还只能在细胞水平和组织水平进行验证，无法进行活体猪个体水平 验证，导致该缺点的主要原因是动物的一种表型的变化受到多方面的影响，一个基因是否 是控制该表型的主效基因还需要很多的研究来证实，并且祀基因与miRNA之间的关系是多 对多，即一个基因也可W是多个miRNA的祀标，一个miRNA可W祀向多个基因，目前发现能控 制表型的主效基因还甚少，即动物的一种表型变化，很难通过一个基因或者其祀标的miRNA 来受到调控;其次，还没有较高把握成功的实验，用猪做活体实验的成本太高。
【发明内容】
[0007] 为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种PIK3R2在猪卵巢颗 粒细胞的应用。
[000引通过基因工程技术改变该PIK3R2基因在颗粒细胞的表达量，进而影响其对颗粒细 胞增殖和调亡;通过生物信息学软件预测该基因祀向的miRNA,研究miRNA的功能，来达到该 PIK3R2基因在猪卵巢颗粒细胞中应用的目的。
[0009] 本发明的另一目的在于提供抑制PIK3R2基因的RNA小干扰片段(SiRNA)。
[0010] 本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0011] 本发明提供一种PIK3R2在猪卵巢颗粒细胞的应用。
[0012] 本发明提供抑制PIK3R2基因的SiRNA,序列如下：
[0013] siRNA-PIK3R2-l: 5^GGAGAAGUUACUUCAGGAA-3';
[0014] siRNA-PIK3R2-2：5' -GGAACAACAAGCUGAUCAA-3^ ；
[0015] siRNA-PIK3R2-3: 5^GGUAUGUAGGCAAGAUCAA-3';
[0016] 本发明提供祀向PIK3R2基因的miRNA，序列如下：
[0017] miR-126-3p:5' -UCGUACCGUGAGUAAUAAUGCG-3';
[0018] 在颗粒细胞中补充外源干扰的PIK3R2后，能回复由miR-126-化引起的细胞功能表 型。
[0019] 本发明的验证结果如下：
[0020] 1、合成3对干扰PIK3R2基因小片段/对照（siRNA-PIK3R2/siRNA-NC)，筛选并检测 其干扰效率。转染基因干扰小片段到颗粒细胞中，通过qRT-PCR手段，最终筛选干扰效果较 好的siRNA-PIK3R2-l小片段进行后续实验。
[0021] siRNA-PIK3R2-l: 5^GGAGAAGUUACUUCAGGAA-3';
[0022] siRNA-PIK3R2-2：5' -GGAACAACAAGCUGAUCAA-3^ ；
[0023] siRNA-PIK3R2-3: 5^GGUAUGUAGGCAAGAUCAA-3';
[0024] 2、干扰PIK3R2基因小片段(siRNA-PIK3R2-l)转染颗粒细胞，研究祀基因 PIK3R2对 猪卵巢颗粒细胞调亡的应用。通过Annexin V-FITC法和Edu法分别检测PIK3R2受到SiRNA-PIK3R2-1小片段干扰后颗粒细胞调亡和增殖情况，发现PIK3R2促进颗粒细胞调亡，抑制颗 粒细胞增殖。
[00巧]3、通过生物信息学软件预测调控PIK3R2的miRNA，发现PIK3R23/UTR中含有miR-126-化结合位点，将PIK3R2野生型3/ UTR和含有种子序列突变的3/ UTR构建到真核表达载体 pmirGLO中，通过双巧光素酶报告系统分析，发现PIK3R2野生型(PIK3R2-WT)3/UTR上游报告 基因受到miR-126-化调控而表达量下降，而突变型(PIK3R2-MUT)载体上报告基因表达则不 受miR-126-化调控(转染50nM的miR-126-化 mimic) dPIK3R2的表达还在转录水平和翻译水 平受miR-126-化的调控，通过qRT-PCR和Western blotting验证（转染50nM的miR-126-化 mimic和IOOnM的miR-126-化 inhibitor)。
[00%] 4、制备miR-126-化模拟物(mimic)和抑制剂（inh化itor)并检测转染效率。在颗粒 细胞中分别转染浓度为50nM的miR-126-化 mimics, W及IOOnM的miR-126-3p inhibitor 后，相对于各自转染的对照组NC，实验组的转染效率分别能达到超表达2000多倍和抑制10 多倍。
[0027] 5、通过检测miR-126-化 mimic和miR-126-化inh化itor转染效率后，检测标记基 因的表达量，W及颗粒细胞调亡的变化。通过qRT-PCR手段，检测miR-126-化介导的调亡标 记基因的表达，发现过表达miR-126-3p(即转染miR-126-化mimiC)抑制了促调亡标记基因 化spase-3的表达，促进了抑调亡标记基因 B化2的表达。并通过Annexin V-門TC法检测miR-126-化对颗粒细胞调亡影响，结果显示过表达miR-126-化抑制颗粒细胞调亡，而抑制miR-126-化促进颗粒细胞调亡。
[002引 6、PIK3R2回复miR-126-3p的功能验证。在颗粒细胞同时共转染miR-126-3p inMbitor和外源被干扰的祀基因 PIK3R2后，检测能否回复由miR-126-化引起的细胞功能 表型。颗粒细胞共转染miR-126-化 inhibitor/NC和PIK3R2干扰小片段siRNA-PIK3R2-l/ siRNA-NC，通过Annexin V-FITC法检测颗粒细胞调亡情况，发现，miR-126-3p引起的抑制颗 粒细胞调亡的功能能够被PIK3R2回复。
[0029] 本发明WPIK3R2为研究对象，采用了细胞生物学方法研究其在猪卵巢颗粒细胞中 的应用。关键点和欲保护点：（1)PIK3R2在猪卵巢颗粒细胞调亡和增殖中的应用；（2)miR-126-化在猪卵巢颗粒细胞调亡中的应用；（3)通过祀基因回复实验，即在颗粒细胞中补充外 源被干扰的PIK3R2后，验证能否回复由miR-126-化引起的细胞功能表型。
[0030] 颗粒细胞的调亡是启动卵泡闭锁的重要机制，本发明第一次证实miR-126-3p、 PIK3R2在猪卵巢颗粒细胞中的应用;现在的发明关于祀基因功能回复实验仅有少量报道， 出现运样的原因主要是一种表型的变化受到多方面的影响，并且miRNA与祀基因之间的关 系是多对多，即一个HiiRNA可W祀向多个基因，一个基因也可W是多个miRNA的祀标，所W祀 基因的回复实验很难得到结果，不过，本发明补充外源干扰的PIK3R2能够回复由miR-126-化引起的细胞功能表型，进一步表明PIK3R2在颗粒细胞中是miR-126-化的一个重要功能祀 标，miR-126-化可W通过PIK3R2来调节颗粒细胞的发育。
[0031] 本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：
[0032] 本发明技术方案设计周详，结果可靠。为证明PIK3R2在颗粒细胞中的应用，本发明 除了研究其自身对颗粒细胞调亡和增殖功能的影响外，还通过调控其表达的miRNA在颗粒 细胞中的功能来进行研究;本发明还通过祀基因回复实验，即在颗粒细胞中补充外源被干 扰的祀基因 PIK3R2后，验证能否回复由miR-126-化引起的细胞功能表型。
【附图说明】
[0033] 图1是qRT-PCR检测3对PIK3R2干扰小片段干