一种局限青霉的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于喷气燃料污染微生物检测技术领域，具体设及一种检测喷气燃料中特 征真菌PeniclIium restrictum的方法。
【背景技术】
[0002] 有研究发现局限青霉(Penicllium restrictum)与储备喷气燃料中的悬浮物有 关，而悬浮物是影响喷气燃料洁净性的一个重要指标。实际油库调查研究发现，被真菌污染 的喷气燃料中发现了局限青霉(Penicllium res化ictum)的影子。局限青霉(Penicllium reShiCturn)是一种常见的丝状真菌，属于杯霉科(DiseeIlaceae )，青霉属（Penicl 1 ium SP)。有研究发现局限青霉可W溶血素，对油库工作人员的身体健康构成威胁。目前，国际航 空运输协会(The International Air Transport Association,IATA)推荐了4种检测方法 针对飞机油箱中的微生物，但是针对局限青霉(PeniclIium restrictum)特异性检测的方 法没有，MicrobMoiter2、Easicult Combi是一种运用培养基培养微生物的定量评估方法， 耗时长，而且局限青霉（Penic 11 ium reStrictum)在普通培养基上生长具有局限性。 FUELSTAT? resinae是一种免疫检测法，定性评估真菌污染情况，虽然检测时间短但成本高 并且操作复杂。因此，有必要提供一种快速灵敏的检测局限青霉(Penicllium restrictum) 新方法。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供一种快速检测喷气燃料中特征性的真菌局限青霉 化eniclIi皿restrict皿)的方法，从而弥补现有技术的不足。
[0004] 本发明首先提供一种检测真菌局限青霉(PeniclIium restrictum)的LAMP引物 组，包括有：
[0005] F3 引物A-F3:5' -AGGGATACCCGCTGAACTT-3' (SEQ ID NO: 1)、
[0006] B3引物A-B3:5'-TCCCATACGGGATTCTCACC-3'(沈Q ID N0:2)、
[0007] FIP引物A-FIP:5'-TTGAGCTCTTGCCGCTTCACTCGCGGAGGAAAAGAAACCAAC-3'(SEQID N0:3)、
[0008] 61口引物八-81口：5'-八1'刊6〔八6八66八16(：1'1'〔666八1'圳八16八〔66〔〇：6刊〇：-3'(569 10 N0:4)、
[0009] LF引物A-LF:5'-GCCGTTACTGGGGCAATC-3'(沈Q ID N0:5)
[0010] LB引物A-LB:5'-GGCCCCCATCTAAGTGCT-3'(沈Q ID N0:6);
[00川作为优选，A-FIP的序列如下：
[0012] 5'-TTGAGCTCTTGCCGCTTCACTCGCGGAGGAAAAGAAACCAAC-3' (SEQ ID NO:7)、
[OOU] A-BIP的序列如下：
[0014] 5^ATTTGCAGAGGATGCTTCGGGATCTATGACGGCCCGTTCC-3^沈Q ID N0:8)。
[0015] 其中A-FIP为5/端进行生物素标记，A-LF的5/端进行异硫氯酸巧光素 FITC标记；
[0016] 本发明还提供一种检测局限青霉(Penicllium res化ictum)的方法，包括如下的 步骤
[0017] 1)配制LAMP反应体系:各引物的终浓度为:各0.2皿ol/L的F3及B3，各1.6皿ol/L的 FIP及BIP，各0 .如mol/L的LF及LB，甜菜碱0.8mol/L，1.4mmol/L的dNTPs，20mmol/L Tris-HCl(pH 8.8)，KC1 10mmol/L，MgS〇4 8mmol/L，Tween-20 0.1%，（NH4)2S04 10mmol/L，Bst DNA聚合酶8U，基因组DNA模板化L，超纯水定容至2如レ
[0018] 2)LAMP反应体系扩增:将上述反应体系进行核酸扩增反应，扩增反应所需溫度为 6rC-65°C，扩增反应所需时间为30min-60min;
[0019] 3)L抑检测：取祉L核酸扩增产物将产物加入到100化Buffer中混匀，然后将L抑试 纸条垂直浸入混合溶液中显色检测，通过试纸条判断扩增结果；
[0020]其中步骤2中所述的最适反应溫度为65°C，最适反应时间为60min。
[0021 ] 本发明所提供的局限青霉(Penicllium restrictum)的LAMP-LFD检测方法具有如 下优点：
[0022] l)高灵敏度:对局限青霉(Peniclliumres1:;rictum)最低检测线为4.2fg/lil，是 PCR 的 1000倍。
[00剖 2)特异性强：
[0024] 3)检测时间较短：只需60min即可完成检测，比PCR检测快了进90min。
[0025] 4)仪器设备要求低，只需一个恒溫加热器即可完成检测，不需要PCR仪、电泳仪和 凝胶成像系统等。
[00%] 5)操作简单、LFD直接将结果可视化，不许借助仪器。
[0027] 6)安全、可靠，相对PCR，擬弃了诸如邸等强毒性物质的使用。
[00巧]综上所述，本发明LAMP-L抑方法检测局限青霉(PeniclIium restrictum)相对于 传统PCR方法，不仅做到了结果可视化，还具有特异性强、操作简单、耗时短、灵敏度高W及 不依赖昂贵的特殊仪器的特点。运用本发明的方法对储备中的喷气燃料进行检测，能更好 地提高了特征真菌污染喷气燃料的预警能力，运对保障喷气燃料质量及飞机的飞行安全有 着重要的意义。
【附图说明】
[0029] 图1:局限青霉18s基因的LAMP-LFD引物和探针设计示意图，引物和探针由方框圈 出、
[0030] 图2:PCR-AGE检测局限青霉的灵敏度图、
[0031] 图3:LAMP-LFD检测微局限青霉灵敏度图、
[0032] 图2和图3中，泳道M为DL2000DNA marker，NC为阴性对照，1泳道为10〇(模板浓度 8.2ng/iiL)，2-9泳道依次为 1〇-1、1〇-2、1〇-3、1〇-4、1〇-5、1〇- 6、1〇-7、IQ-S倍稀释的基因组DNA。
[0033] 图4:PCR-AGE检测局限青霉的特异性图、
[0034] 图5: LAMP检测局限青霉的特异性图、
[0035] 图6: LAMP-LFD检测局限青霉的特异性图；
[0036] 图4、图5和图6中，泳道M为DL2000DNA marker,NC为阴性对照，1-8:局限青霉 (P.restrictum)、歧皱青霉(Penicillium stckii)、指状青霉(Penicillium digitatum)、 靑状曲霉(A.penicillioides)、Khuskia oryzae、枝胞霉菌(Cladosporium resinae)、绿色 木霉菌（Trichoderma viride)W及出芽短梗霉(Aureobasidi皿 pullulans)。
【具体实施方式】
[0037] LAMP-LFD技术是环介导横溫扩增技术（Loop-med i a t ed i S O therma 1 amplification)与横向流动试纸条(Lateral flow dipstick)相结合的一种新颖的微生物 检测技术，该技术将核酸横溫扩增和可视化试纸条检测相结合。环介导等溫扩增技术 (LAMP),只需要在恒溫(60°C-65°C)条件下恒溫几十分钟，即可将所需目的基因扩增到1〇9 水平。横向流动试纸条(LFD)，融合了免疫层析技术和分子生物学手段，可特异性地检测出 该目标产物。环介导横溫扩增技术(LAMP)与横向流动试纸条(L抑)相互结合的技术，使LAMP 扩增产物现场检测得W实现，检测结果明显直观，可视化。LAMP-LFD方法具有安全、快捷、高 效、高灵敏度、高特异性且仪器依赖程度低，具有其他技术所无法替代的优势。
[0038] 本发明分为W下S个部分：1、设计合成3对用于局限青霉(P.res化ic化m)的LAMP 扩增引物，即A-F3和A-B3、A-FIP和A-BIP W及A-LF和A-LB，长度分别为20bp、19bp、40bp、 39bp、2化P和22bp的寡核巧酸序列；2、配制LAMP反应体系，通过LAMP反应程序对样品模板进 行扩增，确定最佳的反应体系和反应条件;3、将A-LF设计为DNA探针，结合LFD技术对LAMP扩 增结果进行分析
[0039] W下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述
[0040] 歧皱青霉(Penicillium stckii)、指状青霉(Penicillium digitatum)、靑状曲霉 (Aspergillus penicillioides CICC2153)、枝胞霉菌(Cladosporium resinae)、局限青霉 化enicllium restrictum CICC40688)、绿色木霉菌（Trichoderma viride CGMCC3.3875)、 出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans CGMCC3.2942)W 及 Khuskia oryzae (CGMCC3.8851 )，除枝抱霉为实验室从喷气燃料中分离保存之外，其余皆由中国工业微生物 保藏管理中屯、(CICC) W及中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、(CGMCC)提供。 W上菌种均选用沙保氏液体培养基培养，放置于摇床培养4d，溫度为25°C。沙保氏液体培养 基的制备简述:?葡萄糖、Ig蛋白腺加入IOOmL的去离子水中混匀，125°C高压灭菌20min，胆 存备用。
[0041 ]实施例1 = LAMP-LFD技术检测喷气燃料中污染真菌局限青霉的方法建立 [0042] 1.1材料与方法
[00创 1.1.1材料
[0044] !"akara Mini肥ST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.50购置宝生物 工程化连巧限公司脱氧核糖核酸扩增试剂盒，荣研生物科技（中国巧限公司，LFD检测试 纸条购自Milenia Biotec GmbH公司（Milenia GenLine HybriDetect MG皿 1 ,Germany)
[0045] 1.1.2 方法
[0046] 1.1.2.1 LAMP