专利名称：用于表达花组织中转基因的lis启动子的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物基因工程。更明确地说，本发明涉及一种衍生自S芳樟醇合酶基因的经分离的启动子，其能够引导植物的至少一朵花中的可操作性地链接到所述启动子的至少一个多核苷酸或选定的基因的高水平表达；涉及在植物的至少一朵花中优先表达的转基因；和含有所述转基因的转化植物。
背景技术：
植物组织中转基因的表达需要存在可操作性链接的启动子，其在该植物内可起作用。启动子序列的选择决定了在植物内表达该(该等)转基因的时间和地点。在所属领域中已知许多不同类型的启动子，如，组成性、可诱导性及组织特异性启动子。当想要连续的转基因表达遍及植物的细胞时，使用组成性启动子(constitutive promoter)。所属领域中已知的组成性启动子包括(但不限于)稻子肌动蛋白1(Wang等人，Molecular andCellular Biology，12(8)3399-3406(1992))，美国专利第5,641,876号)、花椰菜花叶病毒(Cauliflower Mosaic Virus)(CaMV)35S RNA(Odell等人，Nature，313810-812(1985))、CaMV 19S RNA(Lawton等人，Plant Mol.Biol，4995-106(1987))、nos(Ebert等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，845745-5749(1987))、Adhl(Walker等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，846624-6628(1987))及类似物。当需要回应于刺激的基因表达时，使用诱导性启动子。在所属领域中已知的诱导性启动子包括(但不限于)脱落酸ABA和膨压诱导性启动子、生长素结合蛋白基因的启动子(Schwob等人，Plant J.，4(3)423-432(1993))、UDP葡萄糖类黄酮糖基转移酶基因启动子(Ralston等人，Genet，119(1)185-197(1988))及类似物。当想要在特定组织或器官中表达时，使用组织特异性启动子。所属领域中已知的组织特异性启动子的实例包括(但不限于)凝集素(Vodkin等人，Cell，341023(1983)，Lindstron等人，Developmental Genetics，11160(1990))、豌豆小亚单元RuBP羧化酶(Poulsen等人，Mol.Gen.Genet.，205(2)193-200(1986)，Cashmore等人，Gen.Eng.of Plants，Plenum Press，New York 29-38(1983))、Ti质粒甘露氨酸合酶(plasmidmannopine synthase)(Langridge等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，863219-3223(1989))、矮牵牛花查尔酮异构酶(petunia chalcone isomerase)(Van Tunen等人，EMBO J.，71257(1988))及类似物。
尽管在所属领域中已知许多不同类型的启动子，但是需要发现具有有利表达特征的新型启动子，例如具有引导转基因植物中外源基因的高水平表达的能力。
发明内容
在一实施例中，本发明涉及一种编码启动子的经分离的多核苷酸。本发明的启动子能引发植物的至少一朵花中至少一个可操作性链接的多核苷酸或选定的基因的转录。此经分离的多核苷酸具有选自由以下各序列组成的群组的序列SEQ ID NO2及在严格条件下与SEQ ID NO2杂交的序列。本发明也涵盖具有上述序列的片段和变体。一序列能与SEQ ID NO2进行杂交的严格条件可以是低严格条件或高严格条件。低严格条件包括于42℃在2X SSC、0.5％(w/v)SDS溶液中洗涤30分钟并且接着重复所述洗涤。高严格条件包括于65℃在2X SSC、0.5％(w/v) SDS溶液中洗涤30分钟并且接着重复所述洗涤。
在另一实施例中，本发明涉及一种包含一编码启动子的序列的经分离的多核苷酸，该启动子较佳在引发植物的至少一朵花中至少一种可操作性链接的多核苷酸或选定的基因的转录中具有活性。此经分离的多核苷酸具有选自由以下各序列组成的群组的序列SEQ ID NO2及在严格条件下与SEQ ID NO2结合的序列。本发明也涵盖上述序列的片段和变体。一序列能与SEQ ID NO2进行杂交的严格条件可以是低严格或高严格。低严格条件包括于42℃在2X SSC、0.5％(w/v)SDS溶液中洗涤30分钟并且接着重复所述洗涤。高严格条件包括于65℃在2X SSC、0.5％(w/v)SDS溶液中洗涤30分钟并且接着重复所述洗涤。
在又一实施例中，本发明涵盖一种包含上述经分离的启动子的表达盒。本发明的表达盒包含可操作性地链接到多核苷酸序列的上述启动子。此启动子能够引发用所述表达盒转化的植物的至少一朵花中的所述多核苷酸的转录和表达。可操作性地链接到启动子的多核苷酸以正义或反义方向将插入所述表达盒中。
在又一实施例中，本发明涵盖包含上述表达盒的表达载体。
在又一实施例中，本发明涵盖用上述表达盒稳定转的植物或植物部分。可得以转化的植物部分包括(但不限于)细胞、原生质体、细胞组织培养物、愈伤组织(callus)、细胞块、胚芽、花粉、胚珠、花瓣、花柱、雄蕊、叶子、根、根尖和花药(anther)。可被转化的植物可以是单子叶或双子叶植物。单子叶植物的实例包括(但不限于)石蒜科(Amaryllidaceae)(葱属(Allium)、水仙属(Narcissus))；禾本科(Graninae或Poaceae)，(燕麦属(Avena)、大麦属(Horedum)、稻属(Oryza)、黍属(Panicum)、狼尾草属(Pennisetum)、早熟禾属(Poa)、甘蔗属(Saccharum)、黑麦属(Secale)、高梁属(Sorghum)、小麦属(Triticum)、玉米属(Zea))。双子叶植物实例包括(但不限于)夹竹桃科(Apocynaceae)(长春花属(Catharanthus))；紫菀科(Asteraceae)或菊科(Compositae)(紫菀属(Aster)、金盏花属(Calendula)、翠菊属(Callistephus)、菊苣属(Cichorium)、金鸡菊属(Coreopsis)、大丽花属(Dahlia)、菊属(Dendranthema)、杂色菊属(Gazania)、非洲菊(Gerbera)、向日葵属(Helianthus)、蜡菊属(Helichrysum)、莴苣属(Lactuca)、金光菊属(Rudbeckia)、万寿菊属(Tagetes)、百日菊属(Zinnia))；凤仙花科(Balsaminaceae)(凤仙花属(Impatiens))；秋海棠科(Begoniaceae)(秋海棠属(Begonia))；石竹科(Caryophyllaceae)(石竹类属(Dianthus))；藜科(Chenopodiaceae)(甜菜属(Beta)、皂荚(Spinada))；葫芦科(Cucurbitaceae)(西瓜属(Citrullus)、南瓜属(Curcurbita)、甜瓜属(Cucumis))；十字花科(Cruciferae)(庭荠属(Alyssum)、芸苔属(Brassica)、糖芥属(Erysimum)、紫罗兰属(Matthiola)、萝卜属(Raphanus))；龙胆科(Gentinaceae)(洋桔梗(Eustoma))；牻牛儿苗科(Geraniaceae)(天竺葵属(Pelargonium))；大戟科(Euphorbiaceae)(大戟属(Poinsettia))；唇形科(Labiatae)(鼠尾草属(Salvia))；豆科(Leguminosae)(大豆属(Glycine)、山黧豆属(Lathyrus)、苜蓿属(Medicago)、菜豆属(Phaseolus)、豌豆属(Pisum))；百合科(Liliaceae)(百合属(Lilium))；半边莲科(Lobeliaceae)(半边莲属(Lobelia))；锦葵科(Malvaceae)(秋葵属(Abelmoschus)、棉属(Gossypium)、锦葵属(Malva))；蓝雪科(Plumbaginaceae)(补血草属(Limonium))；花荵科(Polemoniaceae)(福禄考属(Phlox))；报春花科(Primulaceae)(仙客来属(Cyclamen))；毛茛科(Ranunculaceae)(乌头属(Aconitum)、银莲花属(Anemone)、耧斗菜属(Aquilegia)、驴蹄草属(Caltha)、翠雀属(Delphinium)、毛茛属(Ranunculus))；蔷薇科(Rosaceae)(蔷薇属(Rosa))；茜草科(Rubiaceae)(繁星花(Pentas))；玄参科(Scrophulariaceae)(天使花属(Angelonia)、金鱼草属(Antirrhinum)、倒地蜈蚣属(Torenia))；茄科(Solanaceae)(辣椒属(Capsicum)、番茄属(Lycopersicon)、烟草属(Nicotiana)、矮牵牛属(Petunia)、茄属(Solatium))；伞形科(Umbelliferae)(芹属(Apium)、胡萝卜属(Daucus)、欧防风属(Pastinaca))；马鞭草科(Verbenaceae)(马鞭草属(Verbena)、马樱丹属(Lantana))；堇菜科(Violaceae)(堇菜属(Viola))。
在又一实施例中，本发明也涵盖由上述含有上述表达盒的植物所产生的种子。
在又一实施例中，本发明涵盖一种包含嵌合启动子的表达盒，所述启动子可操作性地链接到多核苷酸序列。此表达盒中所用的嵌合启动子包括(a)一第一多核苷酸，其能够引发植物的至少一朵花中至少一个可操作性链接的多核苷酸或相关的选定的基因的转录，其中所述多核苷酸具有选自由以下各序列组成的群组的序列SEQ ID NO2及在严格条件下与SEQ ID NO2杂交的序列及其该等序列的片段和变体；及(b)至少一个第二多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列能够引发植物中多核苷酸序列或选定的基因的转录。视情况，造成该嵌合启动子的第二多核苷酸序列具有选自由以下各序列组成的群组的序列SEQ ID NO2及在严格条件下与SEQ ID NO2杂交的序列。这些序列的片段和变体也涵盖在本发明的范围内。可将可操作性地与该嵌合启动子链接的多核苷酸以正义方向或反义方向插入该表达盒中。
在又一实施例中，本发明涉及一种表达载体，其包含一表达盒，包含上述含有该嵌合启动子的表达盒。
在又一实施例中，本发明涉及植物或植物部分，其通过上述含有该嵌合启动子的表达盒来得以稳定转化。可进行转化的植物部分包括(但不限于)细胞、原生质体、细胞组织培养物、愈伤组织、细胞块、胚芽、花粉、胚珠、花瓣、花柱、雄蕊、叶子、根、根尖和花药。能进行转化的植物可以是单子叶植物或双子叶植物。单子叶植物的实例包括(但不限于)石蒜科(Amaryllidaceae)(葱属(Allium)、水仙属(Narcissus))；禾本科(Graninae或Poaceae)(燕麦属(Avena)、大麦属(Horedum)、稻属(Oryza)、黍属(Panicum)、狼尾草属(Pennisetum)、早熟禾属(Poa)、甘蔗属(Saccharum)、黑麦属(Secale)、高梁属(Sorghum)、小麦属(Triticum)、玉米属(Zea))。双子叶植物实例包括(但不限于)夹竹桃科(Apocynaceae)(长春花属(Catharanthus))；紫菀科(Asteraceae)或菊科(Compositae)(紫菀属(Aster)、金盏花属(Calendula)、翠菊属(Callistephus)、菊苣属(Cichorium)、金鸡菊属(Coreopsis)、大丽花属(Dahlia)、菊属(Dendranthema)、杂色菊属(Gazania)、非洲菊(Gerbera)、向日葵属(Helianthus)、蜡菊属(Helichrysum)、莴苣属(Lactuca)、金光菊属(Rudbeckia)、万寿菊属(Tagetes)、百日菊属(Zinnia))；凤仙花科(Balsaminaceae)(凤仙花属(Impatiens))；秋海棠科(Begoniaceae)(秋海棠属(Begonia))；石竹科(Caryophyllaceae)(石竹类属(Dianthus))；藜科(Chenopodiaceae)(甜菜属(Beta)、皂荚(Spinada))；葫芦科(Cucurbitaceae)(西瓜属(Citrullus)、南瓜属(Curcurbita)、甜瓜属(Cucumis))；十字花科(Cruciferae)(庭荠属(Alyssum)、芸苔属(Brassica)、糖芥属(Erysimum)、紫罗兰属(Matthiola)、萝卜属(Raphanus))；龙胆科(Gentinaceae)(洋桔梗(Eustoma))；牻牛儿苗科(Geraniaceae)(天竺葵属(Pelargonium))；大戟科(Euphorbiaceae)(大戟属(Poinsettia))；唇形科(Labiatae)(鼠尾草属(Salvia))；豆科(Leguminosae)(大豆属(Glycine)、山黧豆属(Lathyrus)、苜蓿属(Medicago)、菜豆属(Phaseolus)、豌豆属(Pisum))；百合科(Liliaceae)(百合属(Lilium))；半边莲科(Lobeliaceae)(半边莲属(Lobelia))；锦葵科(Malvaceae)(秋葵属(Abelmoschus)、棉属(Gossypium)、锦葵属(Malva))；蓝雪科(Plumbaginaceae)(补血草属(Limonium))；花荵科(Polemoniaceae)(福禄考属(Phlox))；报春花科(Primulaceae)(仙客来属(Cyclamen))；毛茛科(Ranunculaceae)(乌头属(Aconitum)、银莲花属(Anemone)、耧斗菜属(Aquilegia)、驴蹄草属(Caltha)、翠雀属(Delphinium)、毛茛属(Ranunculus))；蔷薇科(Rosaceae)(蔷薇属(Rosa))；茜草科(Rubiaceae)(繁星花(Pentas))；玄参科(Scrophulariaceae)(天使花属(Angelonia)、金鱼草属(Antirrhinum)、倒地蜈蚣属(Torenia))；茄科(Solanaceae)(辣椒属(Capsicum)、番茄属(Lycopersicon)、烟草属(Nicotiana)、矮牵牛属(Petunia)、茄属(Solatium))；伞形科(Umbeiliferae)(芹属(Apium)、胡萝卜属(Daucus)、欧防风属(Pastinaca))；马鞭草科(Verbenaceae)(马鞭草属(Verbena)、马樱丹属(Lantana))；堇菜科(Violaceae)(堇菜属(Viola))。
在又一实施例中，本发明还涵盖由上述植物所产生的种子，这些种子含有上述包含该嵌合启动子的表达盒。
在又一实施例中，本发明涉及一种经包含启动子的DNA分子稳定转化的转基因植物细胞，所述启动子能引导植物的至少一朵花中的转录。该启动子包含选自由以下各序列组成的群组的序列的多核苷酸SEQ ID NO2及在严格条件下与SEQ ID NO2杂交的序列。这些序列的片段和变体也涵盖在本发明内。用于转化该植物细胞的DNA分子进一步包含一可操作性地与所述启动子链接的选定编码区。此选定编码区处于正义方向或反义方向。另外，该选定编码区可对以下蛋白进行编码抗昆虫性蛋白、抗细菌疾病性蛋白、抗真菌疾病性蛋白、抗病毒疾病性蛋白、花青甙生物合成酶、类胡萝卜素生物合成酶、花香生物合成蛋白、可筛选的标记蛋白或提升花寿命的蛋白。若选定编码区对可筛选的标记物进行编码，则所述可筛选标记物可选自由以下各物组成的群组β-葡糖苷酸酶、β-内酰胺酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、水母发光蛋白和绿色荧光蛋白。若选定编码区对花青甙生物合成酶进行编码，则所述花青甙生物合成酶能够产生以下化合物天竺葵色素(pelargonidin)、矢车菊色素(cyanidin)、翠花素(delphinidin)、芍药色素(peonidin)、锦葵色素(malvidin)和矮牵牛素(petunidin)。若选定编码区对类胡萝卜素生物合成酶进行编码，则所述类胡萝卜素生物合成酶能够产生以下化合物八氢番茄红素、六氢番茄红素、ζ-胡萝卜素、链孢红素(neurosporene)、番茄红素、γ-胡萝卜素、β-胡萝卜素、α-隐黄素、β-隐黄素、角黄素、辣椒红素、辣椒玉红素、玉米黄素、堇菜黄素、新叶黄素、花药黄质、叶黄素和虾青素、阿东尼红素(adonirubin)和金盏花黄素(adonixanthin)。
一序列可与SEQ ID NO2杂交的该严格条件可以是低严格条件或高严格条件。低严格条件包括于42℃在2X SSC、0.5％(w/v)SDS溶液中洗涤30分钟并且接着重复所述洗涤。高严格条件包括于65℃在2X SSC、0.5％(w/v)SDS溶液中洗涤30分钟并且接着重复所述洗涤。
在又一实施例中，本发明涉及一种用于选择性地表达转基因植物的至少一朵花中第一多核苷酸序列的方法。该方法包括以下步骤用包含一表达盒的表达载体来转化植物或植物细胞，所述表达盒包含一启动子和一可操作性地与所述启动子链接的第一多核苷酸，其中该启动子能够引发转录并引导植物的至少一朵花中所述第一多核苷酸序列的表达，并且包括具有一选自由以下各序列组成的群组的序列的多核苷酸SEQ ID NO2及在严格条件下与SEQ ID NO2杂交的序列。这些序列的片段和变体也涵盖在本发明的范围之内。将该第一多核苷酸以正义方向或反义方向插入到该表达盒中。
一序列可与SEQ ID NO2杂交的该严格条件可以是低严格条件或高严格条件。低严格条件包括于42℃在2X SSC、0.5％(w/v)SDS溶液中洗涤30分钟并且接着重复所述洗涤。高严格条件包括于65℃在2X SSC、0.5％(w/v)SDS溶液中洗涤30分钟并且接着重复所述洗涤。
插入该表达盒中的第一多核苷酸序列可编码以下蛋白抗昆虫性蛋白、抗细菌疾病性蛋白、抗真菌疾病性蛋白、抗病毒疾病性蛋、花青甙生物合成酶、类胡萝卜素生物合成酶、花香生物合成蛋白、可筛选的标记蛋白或提升花寿命的蛋白。若该第一多核苷酸序列对可筛选的标记蛋白进行编码，则所述可筛选的标记蛋白可选自由以下各物组成的群组β-葡糖苷酸酶、β-内酰胺酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、水母发光蛋白和绿色荧光蛋白。若该第一多核苷酸序列对花青甙生物合成酶进行编码，则所述花青甙生物合成酶能够产生以下化合物天竺葵色素、矢车菊色素、翠花素、芍药色素、锦葵色素和矮牵牛素。若所述第一多核苷酸序列对类胡萝卜素生物合成酶进行编码，则该类胡萝卜素生物合成酶能够产生以下化合物八氢番茄红素、六氢番茄红素、ζ-胡萝卜素、链孢红素(neurosporene)、番茄红素、γ-胡萝卜素、β-胡萝卜素、α-隐黄素、β-隐黄素、角黄素、辣椒红素、辣椒玉红素、玉米黄素、堇菜黄素、新叶黄素、花药黄质、叶黄素和虾青素、阿东尼红素(adonirubin)和金盏花黄素(adonixanthin)。
被转化的植物或植物细胞可来自于单子叶植物，其包括(但不限于)石蒜科(Amaryllidaceae)(葱属(Allium)、水仙属(Narcissus))；禾本科(Graninae或Poaceae)，(燕麦属(Avena)、大麦属(Horedum)、稻属(Oryza)、黍属(Panicum)、狼尾草属(Pennisetum)、早熟禾属(Poa)、甘蔗属(Saccharum)、黑麦属(Secale)、高梁属(Sorghum)、小麦属(Triticum)、玉米属(Zea))。或者，被转化的植物或植物细胞可来自于双子叶植物，其包括(但不限于)夹竹桃科(Apocynaceae)(长春花属(Catharanthus))；紫菀科(Asteraceae)或菊科(Compositae)(紫菀属(Aster)、金盏花属(Calendula)、翠菊属(Callistephus)、菊苣属(Cichorium)、金鸡菊属(Coreopsis)、大丽花属(Dahlia)、菊属(Dendranthema)、杂色菊属(Gazania)、非洲菊(Gerbera)、向日葵属(Helianthus)、蜡菊属(Helichrysum)、莴苣属(Lactuca)、金光菊属(Rudbeckia)、万寿菊属(Tagetes)、百日菊属(Zinnia))；凤仙花科(Balsaminaceae)(凤仙花属(Impatiens))；秋海棠科(Begoniaceae)(秋海棠属(Begonia))；石竹科(Caryophyllaceae)(石竹类属(Dianthus))；藜科(Chenopodiaceae)(甜菜属(Beta)、皂荚(Spinada))；葫芦科(Cucurbitaceae)(西瓜属(Citrullus)、南瓜属(Curcurbita)、甜瓜属(Cucumis))；十字花科(Cruciferae)(庭荠属(Alyssum)、芸苔属(Brassica)、糖芥属(Erysimum)、紫罗兰属(Matthiola)、萝卜属(Raphanus))；龙胆科(Gentinaceae)(洋桔梗(Eustoma))；牻牛儿苗科(Geraniaceae)(天竺葵属(Pelargonium))；大戟科(Euphorbiaceae)(大戟属(Poinsettia))；唇形科(Labiatae)(鼠尾草属(Salvia))；豆科(Leguminosae)(大豆属(Glycine)、山黧豆属(Lathyrus)、苜蓿属(Medicago)、菜豆属(Phaseolus)、豌豆属(Pisum))；百合科(Liliaceae)(百合属(Lilium))；半边莲科(Lobeliaceae)(半边莲属(Lobelia))；锦葵科(Malvaceae)(秋葵属(Abelmoschus)、棉属(Gossypium)、锦葵属(Malva))；蓝雪科(Plumbaginaceae)(补血草属(Limonium))；花荵科(Polemoniaceae)(福禄考属(Phlox))；报春花科(Primulaceae)(仙客来属(Cyclamen))；毛茛科(Ranunculaceae)(乌头属(Aconitum)、银莲花属(Anemone)、耧斗菜属(Aquilegia)、驴蹄草属(Caltha)、翠雀属(Delphinium)、毛茛属(Ranunculus))；蔷薇科(Rosaceae)(蔷薇属(Rosa))；茜草科(Rubiaceae)(繁星花(Pentas))；玄参科(Scrophulariaceae)(天使花属(Angelonia)、金鱼草属(Antirrhinum)、倒地蜈蚣属(Torenia))；茄科(Solanaceae)(辣椒属(Capsicum)、番茄属(Lycopersicon)、烟草属(Nicotiana)、矮牵牛属(Petunia)、茄属(Solatium))；伞形科(Umbelliferae)(芹属(Apium)、胡萝卜属(Daucus)、欧防风属(Pastinaca))；马鞭草科(Verbenaceae)(马鞭草属(Verbena)、马樱丹属(Lantana))；堇菜科(Violaceae)(堇菜属(Viola))。
在又一实施例中，本发明涉及一种用来表达转基因植物的至少一朵花中的选定蛋白质的方法。该方法的第一步涉及获得包含一选定编码区的表达载体，该编码区可操作性地与能引发植物花中转录的启动子相链接。该启动子包含具有一选自由以下各序列组成的群组的序列的多核苷酸SEQ ID NO2及在严格条件下与SEQ ID NO2杂交的序列。这些序列的片段和变体也涵盖在本发明的范围之内。第二步涉及用所述载体转化受体植物细胞。第三步涉及从所述受体植物细胞再生表达所述选定蛋白的转基因植物。
在该表达盒中所施用的选定编码区可处以正义方向或反义方向。一序列可与SEQ IDNO2杂交的该严格条件可以是低严格条件或高严格条件。低严格条件包括于42℃在2X SSC、0.5％(w/v)SDS溶液中洗涤30分钟并且接着重复所述洗涤。高严格条件包括于65℃在2X SSC、0.5％(w/v)SDS溶液中洗涤30分钟并且接着重复所述洗涤。
可使用所属领域中已知的技术来进行植物细胞的转化，这些技术包括(但不限于)粒子枪法(microproiectile bombardment)、聚乙二醇介导的原生质体的转化、电穿孔和土壤杆菌介导的转化。被转化的受体植物细胞可来自单子叶植物或双子叶植物。单子叶植物的实例包括(但不限于)石蒜科(葱属(Allium)、水仙属(Narcissus))；禾本科(Graninae或Poaceae)，(燕麦属(Avena)、大麦属(Horedum)、稻属(Oryza)、黍属(Panicum)、狼尾草属(Pennisetum)、早熟禾属(Poa)、甘蔗属(Saccharum)、黑麦属(Secale)、高梁属(Sorghum)、小麦属(Triticum)、玉米属(Zea))。双子叶植物实例包括(但不限于)夹竹桃科(Apocynaceae)(长春花属(Catharanthus))；紫菀科(Asteraceae)或菊科(Compositae)(紫菀属(Aster)、金盏花属(Calendula)、翠菊属(Callistephus)、菊苣属(Cichorium)、金鸡菊属(Coreopsis)、大丽花属(Dahlia)、菊属(Dendranthema)、杂色菊属(Gazania)、非洲菊(Gerbera)、向日葵属(Helianthus)、蜡菊属(Helichrysum)、莴苣属(Lactuca)、金光菊属(Rudbeckia)、万寿菊属(Tagetes)、百日菊属(Zinnia))；凤仙花科(Balsaminaceae)(凤仙花属(Impatiens))；秋海棠科(Begoniaceae)(秋海棠属(Begonia))；石竹科(Caryophyllaceae)(石竹类属(Dianthus))；藜科(Chenopodiaceae)(甜菜属(Beta)、皂荚(Spinada))；葫芦科(Cucurbitaceae)(西瓜属(Citrullus)、南瓜属(Curcurbita)、甜瓜属(Cucumis))；十字花科(Cruciferae)(庭荠属(Alyssum)、芸苔属(Brassica)、糖芥属(Erysimum)、紫罗兰属(Matthiola)、萝卜属(Raphanus))；龙胆科(Gentinaceae)(洋桔梗(Eustoma))；牻牛儿苗科(Geraniaceae)(天竺葵属(Pelargonium))；大戟科(Euphorbiaceae)(大戟属(Poinsettia))；唇形科(Labiatae)(鼠尾草属(Salvia))；豆科(Leguminosae)(大豆属(Glycine)、山黧豆属(Lathyrus)、苜蓿属(Medicago)、菜豆属(Phaseolus)、豌豆属(Pisum))；百合科(Liliaceae)(百合属(Lilium))；半边莲科(Lobeliaceae)(半边莲属(Lobelia))；锦葵科(Malvaceae)(秋葵属(Abelmoschus)、棉属(Gossypium)、锦葵属(Malva))；蓝雪科(Plumbaginaceae)(补血草属(Limonium))；花荵科(Polemoniaceae)(福禄考属(Phlox))；报春花科(Primulaceae)(仙客来属(Cyclamen))；毛茛科(Ranunculaceae)(乌头属(Aconitum)、银莲花属(Anemone)、耧斗菜属(Aquilegia)、驴蹄草属(Caltha)、翠雀属(Delphinium)、毛茛属(Ranunculus))；蔷薇科(Rosaceae)(蔷薇属(Rosa))；茜草科(Rubiaceae)(繁星花(Pentas))；玄参科(Scrophulariaceae)(天使花属(Angelonia)、金鱼草属(Antirrhinum)、倒地蜈蚣属(Torenia))；茄科(Solanaceae)(辣椒属(Capsicum)、番茄属(Lycopersicon)、烟草属(Nicotiana)、矮牵牛属(Petunia)、茄属(Solatium))；伞形科(Umbelliferae)(芹属(Apium)、胡萝卜属(Daucus)、欧防风属(Pastinaca))；马鞭草科(Verbenaceae)(马鞭草属(Verbena)、马樱丹属(Lantana))；堇菜科(Violaceae)(堇菜属(Viola))。
图1A显示具有寡核苷酸引物(BHX30及BHX36)的LIS1启动子的多核苷酸序列。图1A中所示的多核苷酸序列长为1048个碱基对并且在核苷酸3-8含有Hind III位点且在核苷酸1040-1045含有Sma I位点。
图1B显示具有寡核苷酸引物BHX30的核苷酸序列。此引物构成图1A中所示多核苷酸序列的核苷酸1-29。
图1C显示寡核苷酸引物BHX36的核苷酸序列。此引物与图1A中所示多核苷酸序列的核苷酸1018-1048反向互补。
图2显示用含有LIS1启动子的质粒与用含有35S RNA组成性启动子的质粒所转化的转基因矮牵牛花株之间GUS表达的差异照片。
图3显示来自于经含有LIS1::crtB::nos的pBHX112转化的植物中的矮牵牛花断片的RNA凝胶墨点分析(RNA gel blot analysis)。
具体实施例方式
引言本发明涉及一种衍生自S-芳樟醇合酶基因的多核苷酸序列作为启动子引发特定组织如植物的至少一朵花的转录的用途。本发明的多核苷酸序列可用于表达植物的至少一朵花中相关的蛋白质。
定义本文所提供的标题并不限制可参照本说明书作为一个整体的本发明的各个方面或实施例。因此，以下即将定义的该等术语将参照本说明书作为一个整体得到更详细的定义。
本文所用短语“外源编码区”或“选定编码区”是指一被引入或再引入有机体内的(多个)多核苷酸或(多个)选定基因的编码区。举例来说，如果为类胡萝卜素叶黄素编码的编码区(来自(多个)多核苷酸或(多个)选定基因)被引入或再引入有机体(例如，植物，如金盏花)，那么将其视作一外源编码区或选定编码区。
本文所用术语“表达”是指细胞内过程的组合，包括编码用DNA分子如结构基因或多核苷酸为产生多肽所经历的转录或翻译。
本文所用术语“表达盒”是指为通过基因转化引入宿主基因组而设计的嵌合DNA分子。本发明的优选表达盒包含为引导选定基因或多核苷酸序列的表达所必需的所有遗传成分。本发明的该(该等)表达盒包括LIS1启动子或LIS1嵌合启动子。
本文所用术语“表达载体”是指一包含至少一个表达盒的基于DNA的载体。
本文所用术语“基因”是指染色体DNA、质粒DNA、cDNA、合成DNA，或用于编码肽、多肽、蛋白质或RNA分子及位于基因调控所涉及的编码用序列两侧的区域的其他DNA。
本文所用术语“(多个)宿主”是指细菌、整个植物、小植物、或植物部分，诸如植物细胞、原生质体、愈伤组织、根、块茎、繁殖体、种子、秧苗、花粉和植物组织。
本文所用术语“经分离的”是指如多核苷酸或蛋白质的物质，其为(a)大体上或基本上不含如在天然发生环境中所发现的通常伴随该物质或与该物质相互作用的组分；或(b)如果该物质在其天然环境中，那么使该物质通过对组合物进行蓄意人类干预加以改变及/或将其安置在细胞中除该物质天然轨迹(locus)外的轨迹处。
本文所用术语“标记基因”是指一种赋予表达该标记基因的细胞独特显型并且允许已转化的细胞区别于不具有该标记基因的细胞的基因。这些基因可对能通过观察或测试来识别的可筛选标记物(即，例如通过筛选，如绿色荧光蛋白)进行编码。
本文所用术语“组织优选的”是指在执行特定功能的细胞的任何群组中具有最高水平的多核苷酸或选定基因表达。在所属领域中已知用于测定细胞群组中最高水平的(多个)多核苷酸或(多个)基因表达的技术，且包括(但不限于)组织化学分析和荧光分析。
本文所用术语“花优选的”是指植物的至少一朵花中至少一个多核苷酸或经选定基因的有利表达。
本文所用术语“花瓣优选的”是指在花的花瓣组织中具有最高水平的多核苷酸或选定基因表达。在所属领域中已知用于测定细胞群组中最高水平的多核苷酸或基因表达的技术，且包括(但不限于)组织化学分析和荧光分析。
本文所用术语“(多个)植物部分”或“植物的(多个)部分”是指细胞、原生质体、细胞组织培养物、(多个)愈伤组织、细胞块、胚芽、花粉、胚珠、花瓣、花柱、雄蕊、叶子、根、根尖和花药。
本文所用术语“多核苷酸”是指任何长度的核苷酸的聚合形式，或为核糖核苷酸或为脱氧核糖核苷酸。此术语包括双股和单股DNA以及双股和单股RNA。也包括多核苷酸的修饰(例如甲基化或封端(capping))和未修饰形式。
本文所用术语“启动子”是指在为多核苷酸或选定基因提供表达控制元素的DNA序列或DNA序列群组上的且可特异结合RNA聚合酶并引发该基因的转录(RNA合成)的识别位点。启动子通常是由转录起始、调控和效率中所涉及的几个调控元素组成，其可能是接近于转录起始位点的上百或者甚至上千个核苷酸。这些调控元素包括(但不限于)TATA盒子、增强子、下游活化序列等。
本文所用术语“选定基因”是指在转基因植物、植物细胞或植物部分中待表达的基因。选定基因对宿主基因组而言可以是天然的或是外来的。当该选定基因存在于宿主基因组中时，其包括不同于该基因的(多个)天然复本的一个或多个调控或功能元素。
本文所用术语“转化细胞”是指通过引入外源DNA分子(即，外源编码区)来改变其互补DNA的细胞。该“外源DNA分子”包括(1)原本不存在于该细胞中的(多个)序列；和(2)对该被转化的细胞而言是天然的且被再引入到所述细胞中的序列。
本文所用术语“转基因”是指已经被并入宿主基因组或能在宿主细胞中自主复制并能引起一个或多个细胞产物的表达的DNA片段。
本文所用术语“转基因植物”是指植物或具有自其衍生的任何后代的植物的后裔(progeny)，其中该植物的DNA或其后裔含有在相同菌株的非转基因植物中原本不存在的经引入的外源DNA分子。该转基因植物也含有对转化植物而言天然的序列，但是其中该“外源”基因已被修改以改变该基因的表达水平或模式。
本文所用术语“转运肽”是指能够将多肽引入细胞内特定细胞器或其他位置的多肽序列。
本文所用术语“载体”是指能够在宿主细胞中复制并且/或者可使另一DNA分子与其可操作性链接以引起所附着的片段的复制的DNA分子。质粒是载体的一个实例。
序列表本申请案也含有5种多核苷酸和/或氨基酸序列。对于该等多核苷酸序列，由下列碱基密码来表示碱基对
本申请案中所示氨基酸为L型且由下列氨基酸-三字母缩写来表示
优选实施例描述在一实施例中，本发明涉及一种衍生自编码启动子的S芳樟醇合酶(LIS)基因的经分离的多核苷酸序列的用途。本文所述多核苷酸序列能引导植物的至少一朵花中相关的可任意可操作性链接的(多个)多核苷酸或(多个)选定基因的表达。已发现该表达不仅为花优选的，而且更明确地说是为花瓣优选的。
编码本发明启动子的多核苷酸序列显示在图1的SEQ ID NO2和核苷酸7-1033中(下文称为“LIS1启动子”)。此多核苷酸序列是衍生自从山字草(Clarkia brewerii)得到的S-芳樟醇合酶基因(SEQ ID NO1)。从山字草得到的S-芳樟醇合酶基因的完整多核苷酸和氨基酸序列在Genbank Accession AF067601(SEQ ID NO1)和Cseke，L.等人的Mol.Biol.Evol，151491-1498(1998)中有描述。该S-芳樟醇合酶基因为S-芳樟醇合酶、催化S芳樟醇生成的花香生物合成酶、挥发性类单萜进行编码(Dudareva等人，The PlantCell，81137-1148(1996))。
另一种花香化合物苯甲酸羧基甲基转移酶是苯甲酸甲酯生物合成中的最后产物酶，且已知是金鱼草花中最丰富的香味化合物。在金鱼草中，已发现大部分BAMT基因活性是在花冠的上叶片和下叶片中(Dudareva等人，The Plant Cell，12949-961(2000))。一实例证明了来自该BAMT基因的启动子不引导转基因矮牵牛花花瓣组织中的外源基因表达。因此，不能假定此启动子在其他种类中是花瓣优选的启动子。
本发明的启动子可用于以其他启动子序列与本发明启动子序列的同源性为基础使用所属领域中已知的常规技术来从其他有机体中分离出其他启动子。在这些技术中，将本发明的全部或部分启动子用作探针，其选择性地与独特的且较佳为至少约10个核苷酸长及最佳至少约20个核苷酸长的其它序列进行杂交。这些探针可用于利用聚合酶链反应(“PCR”)来增强来自所选有机体的相应启动子。此技术可用于将额外启动子自所要的有机体分离开来或者作为测定有机体中启动子的存在的诊断分析。实例包括经镀积的DNA库的杂交筛选(斑片或菌落；参看例如Innis等人，PCR Protocols，A Guide to Methodsand Applications，eds.，Academic Press(1990))。
本发明也包括对应于本发明启动子并与本发明启动子杂交且与所揭示的序列至少50％同源、70％同源、85％同源、90％同源、95％同源且甚至99％同源的序列。也就是说，探针与目标之间的序列相似性可能在至少约50％、约70％、约85％、约90％、约95％且甚至约99％序列相似性的范围内。
排列用于比较的序列的方法在所属领域中已为人熟知。可通过在用于缺省参数下实施BLAST(Basic Local Alignment Search Tool；Altschul，S.F.等人，J.Mol.Biol.215403-410(1993)；同时参看www.ncbi.nlm.gov/BLAST/)研究在BLAST“GENEMBL”数据库中所含的序列的同一性来加以测定。可在缺省参数下使用BLASTN算法来分析一个序列与GENEMBL数据库中所含全部公开可得DNA序列的同一性。本发明序列的同一性是指多核苷酸序列具有至少50％序列同一性、更佳至少70％序列同一性、更佳至少70％序列同一性、更佳至少80％序列同一性、更佳至少85％序列同一性、更佳至少90％序列同一性、更佳至少95％序列同一性且最佳至少99％序列同一性，其中序列同一性百分比是基于该整个启动子。
可利用所属领域中常规技术例如通过使用严格条件来鉴别与本发明多核苷酸序列(SEQ ID NO2)杂交的多核苷酸序列。本文所用术语“严格条件”或“严格杂交条件”包括对探针将与其目标序列进行杂交至比其它序列在可探测性上具有更大程度(例如，超过背景至少两倍)的条件的参考。严格条件是依赖于目标序列的且视多核苷酸的结构而不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可鉴别出与探针(此类型探测被称为“同源探测”)100％互补的目标序列。或者，可调节严格条件以允许序列中的某些错配以便探测到低程度的相似性(此类型探测被称为“异源探测”)。一般来说，此类型的探针在约100个核苷酸长到约250个核苷酸长的范围之内。
在Tijssen的Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology-Hybridization with Nucleic Acid Probes，第I部分，第2章，″Overview of principlesof hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays″，Elsevier，N.Y.(1993)；和Current Protocols in Molecular Biology，第2章，Ausubel等人编，Greene Publishing andWiley-Initerscience，New York(1995)中发现了核酸杂交的广泛指导。同时参阅Sambrook等人的Molecular CloningA Laboratory Manual(第2版.Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989))。
特异性通常是杂交后洗涤的功能，临界因素为离子强度和最终洗涤溶液的温度。一般来说，将严格洗涤温度条件选择为比在所定义离子强度和pH值下特定序列的熔点(Tm)低约5℃到约2℃。DNA的熔点或变性发生在狭窄温度范围内并且代表双螺旋分裂为其互补的单股。通过转变中点的温度Tm(也叫熔解温度)来描述此过程。用于确定熔解温度的公式在所属领域中是已知的。
用于本发明启动子的优选杂交条件包括在42℃下在50％(w/v)甲酰胺、6x标准盐水柠檬酸盐(“SSC”)、0.5％(w/v)十二烷基硫酸钠(“SDS”)、100μg/ml鲑鱼精子DNA中进行杂交。示例性低严格洗涤条件包括在42℃下在2X SSC、0.5％(w/v)SDS的溶液中杂交30分钟并重复。示例性中度严格条件包括在50℃下在2X SSC、0.5％(w/v)SDS中洗涤30分钟并重复。示例性高严格条件包括在65℃下在2X SSC、0.5％(w/v)SDS中洗涤30分钟并重复。利用所有上述条件可获得对应于本发明启动子的序列。
本发明也涵盖衍生自本发明启动子(即，SEQ ID NO2)的片段和变体。本文所用“(多个)片段”是指多核苷酸序列的部分。本发明的该(等)片段包括SEQ ID NO2的一部分。这些片段可保留生物活性并因此包括能引导植物的至少一朵花中可操作性链接的(多个)多核苷酸或(多个)选定基因的表达的片段。本发明启动子的多核苷酸片段包括至少20、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1010个核苷酸，或高达本文所揭示的全长LIS1启动子中所存在的核苷酸的数目。该等多核苷酸片段通常将包括特定启动子序列的TATA识别序列(也叫做TATA盒子)。该等片段可通过以下手段而获得利用限制酶分裂本文所揭示的启动子的多核苷酸序列；通过从天然发生启动子DNA序列合成多核苷酸序列；或可通过使用PCR技术而获得。特别参阅Mullis等人的Methods Enzymol.155335-350(1987)和Erlich，第1版.(1989)PCR Technology(Stockton Press，N.Y.(1989))。
如以上简述，本发明也涵盖本发明启动子(SEQ ID NO2)的变体。本文所用术语“(多个)变体”是指大体上相似的序列。利用所属领域中已知的常规技术(如聚合酶链反应)可鉴别出天然发生的变体。变异的多核苷酸序列也包括以合成方式衍生出的多核苷酸序列，例如通过定点突变所产生的多核苷酸序列，其在下面有更详细的描述。生物学上的活性变体也包括在本发明的范围内。
可利用所属领域中已知的常规技术通过插入、缺失或变异SEQ ID NO2来产生本发明启动子的变体。举例来说，如上简述，这些变体包括由SEQ ID NO2的定位突变而产生的序列。用于执行定点突变的技术在Mikaelian等人的Nucl.Acids Res.，20376(1992)、Zhou等人的Nucl.Acids Res.，196052(1991)中有描述。另外，本发明包括达到转录起始位点附近的TATA盒子的启动子的5′部分的变体，该部分可缺失而不消除启动子活性，如Zhu等人The Plant Cell 71681-89(1995)中所述。该等变体应保留引导在植物的至少一朵花中的表达的能力。
本发明的多核苷酸序列可用于引导在植物的至少一朵花中来自于编码特定蛋白或多肽产物或RNA分子的可操作性链接的(多个)多核苷酸和/或(多个)选定基因的选定编码区的表达。与用于受体植物细胞的转化的LIS1启动子联合使用的特定选定编码区的选择将取决于转化的目的。植物转化的主要目的之一是增加植物商业上所要的、农艺上或园艺上重要的性状。这些性状包括(但不限于)昆虫抗性或耐性、疾病抗性或耐性(病毒、细菌、真菌)、颜色(例如(1)花青甙(例如通过花青甙生物合成酶的产生或增加的表达，此酶产生花青甙化合物，如(但不限于)天竺葵色素、矢车菊色素、翠花素、芍药色素、锦葵色素、矮牵牛素和其类似物(对产生上述化合物的花青甙生物合成酶进行编码的多核苷酸和基因序列在所属领域中是已知的并且在Holton等人的ThePlant Cell，71071-1083(1995)中有所描述)，和/或(2)类胡萝卜素(例如通过类胡萝卜素生物合成酶的产生或增加的表达，此酶产生化合物如(但不限于)八氢番茄红素、六氢番茄红素、ζ-胡萝卜素、链孢红素、番茄红素、γ-胡萝卜素、β-胡萝卜素、α-隐黄素、β-隐黄素、角黄素、辣椒红素、辣椒玉红素、玉米黄素、堇菜黄素、新叶黄素、花药黄质、叶黄素、虾青素、阿东尼红素(adonirubin)、金盏花黄素(adionixanthin)和其类似物(对产生上述类胡萝卜素化合物的类胡萝卜素生物合成酶进行编码的多核苷酸和基因序列在所属领域中是已知的并且在WO 00/32788和美国专利第5,684,238号、第5,530,188号、第5,429,939号及第5,618,988号，Cunningham and Gantt，Breeding forOrnamentalsClassical and Molecular Approaches，ed.A.Vainstein(Kluwer AcademicPublishers，Dordrecht(2002))，Chamovitz等人，FEBS Lett，296(3)305-310(1992)，Chappell，J.，Ann.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol，46521-547(1995)，Cunningham等人，FEBS Lett，328(1-2)130-138(1993)，Hugueney等人，Eur.J.Biochem.，209(1)399-407(1992)，Hundle等人，FEBS Lett，315(3)329-334(1993)，Kajiwara等人，Plant Mol.Biol，29(2)343-352(1995)，Kuntz等人，Plant J.，2(1)25-34(1992)，Linden等人，Plant Mol.Biol，24(2)369-79(1994)，Lotan等人，FEBS Lett，364(2)125-128(1995)，Math等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89(15)6761-6764(1992)，Misawa等人，J.Bacteriol，172(12)6704-6712(1990)，Misawa等人，J.Biochem.(Tokyo)，116(5)980-985(1994)，Sandmann，G.，FEMS MicrobiolLett，69(3)253-257(1992)，Sandmann等人，FEMS Microbiol Lett，59(1-2)77-82(1990)及Kajiwara等人，Biochem.J.，324421-426(1997))中有所描述))、花香、花寿命等。该选定编码区可在正义方向或反义方向上与本发明的启动子一起使用。
在另一实施例中，本发明涉及一种嵌合启动子，其可用于引导在植物的至少一朵花中来自于编码特定蛋白或多肽产物或RNA分子的可操作性链接的(多个)多核苷酸和/或(多个)选定基因的选定编码区的表达。更具体地说，可使用所属领域中已知的常规技术使本发明的多核苷酸或其片段或变体可操作性地链接到另一启动子以形成嵌合启动子(下文称为“LIS1嵌合启动子”)。举例来说，可使本发明的启动子可操作性地链接到CaMV35S启动子的特定区域以引导在植物的至少一朵花中可操作性地链接到所述嵌合启动子的至少一个多核苷酸或选定基因的高水平表达。用于制造LIS1嵌合启动子的启动子连同本发明的LIS1启动子不仅仅必须引导在植物的花中多核苷酸或选定基因的表达。事实上，此启动子并不必须仅是组织特异性启动子。视情况，所述启动子可以是组成性启动子或所属领域中为人熟知的诱导性启动子。
与用于转化的LIS1嵌合启动子联合使用的特定选定编码区的选择将取决于转化的目的。植物转化的主要目的之一是增加植物商业上所要的、农艺上或园艺上重要的性状。这些性状包括(但不限于)昆虫抗性或耐性、疾病抗性或耐性(病毒、细菌、真菌)、颜色(例如(1)花青甙(例如通过花青甙生物合成酶的产生或增加的表达，此酶产生花青甙化合物如(但不限于)天竺葵色素、矢车菊色素、翠花素、芍药色素、锦葵色素、矮牵牛素和类似物)，和/或(2)类胡萝卜素(例如通过类胡萝卜素生物合成酶的产生或增加的表达，此酶产生类胡萝卜素化合物如(但不限于)八氢番茄红素、六氢番茄红素、ζ-胡萝卜素、链孢红素、番茄红素、γ-胡萝卜素、β-胡萝卜素、α-隐黄素、β-隐黄素、角黄素、辣椒红素、辣椒玉红素、玉米黄素、堇菜黄素、新叶黄素、花药黄质、叶黄素、虾青素、阿东尼红素(adonirubin)、金盏花黄素(adonixanthin)和其类似物))、花香、花寿命等。该特定选定的编码区可在正义方向或反义方向上与LIS1嵌合启动子一起使用。
在另一实施例中，本发明涵盖具有不止一个转化构造的受体细胞的转化。可利用独特的选定蛋白编码用载体，或者使用合并有两个或两个以上多核苷酸或选定基因序列的单一载体在单一转化事件中创造出两个或两个以上的转基因。可按需要采用任何描述的任何两个或两个以上的转基因，例如那些赋予(例如)昆虫或疾病(病毒、细菌、真菌)抗性、对颜色或花香或花寿命的改变(降低或增加)的转基因。
在又一实施例中，本发明涵盖使用两个(2)或两个以上载体的植物或植物细胞的共转化。可使用含有标记物和一种或多种多核苷酸或相关的选定基因的载体来实现共转化。或者，不同载体(例如(但不限于)质粒)可含有不同的多核苷酸或相关的选定基因，且该等质粒可被同时传送到受体宿主细胞。根据此方法，假定一定百分数的细胞(其中已引入标记物)也已经接收了相关的其它多核苷酸或选定基因。因此，并非所有凭借标记物所选定的细胞都将表达已被同时呈现给该等细胞的相关的其它蛋白质。
适用于植物转化的任何载体可用于本发明中。这些载体包括(但不限于)质粒、柯斯质粒(cosmid)、酵母人工染色体(“YAC”)、细菌人工染色体(“BAC”)或其它任何合适的克隆系统。我们预期利用具有巨大插入容量的克隆系统将会允许引入包含不止一个的选定基因的巨大DNA序列。通过使用BAC、YAC或植物人工染色体可便于该等序列的引入。
从先前所述的载体分离出的表达盒可用于转化。用于使植物细胞转化的DNA分子通常将包含cDNA或者待引入并在受体宿主细胞中表达的一个或多个选定基因或多核苷酸。除LIS1启动子或LIS1嵌合启动子外，该等DNA分子可进一步包括以下结构如增强子、多接头(polylinker)、内含子、终止子或影响基因表达的其它调控元素或基因。用于使植物细胞转化的DNA分子可以正义方向或反义方向插入到表达盒中并将通常对蛋白质进行编码，该蛋白质将被表达在所得的重组细胞中导致可筛选的或可选择的性状且/或将赋予所得转基因植物经改良的显型。但是，情况并非总是如此，并且本发明也包括转基因植物或植物部分，其合并有未经表达的转基因或非编码用RNA(例如，反义RNA分子、编码核糖酶的多核苷酸或者能够促进核糖核酸酶P介导的目标RNA分子分裂的多核苷酸)。
如上所述，增强子序列可被包括在含有LIS1启动子或LIS1嵌合启动子的转化构造中并且可操作性地链接到一相关的多核苷酸或选定基因的编码区。可在真核细胞中起作用的启动子中5′到转录起始发现增强子序列。有时，在内含子内发现这些增强子序列。增强子序列可于前向或反向方向5′或3′插入到相关的多核苷酸或选定基因的编码序列。根据本发明可使用的增强子实例包括来自CaMV 35S RNA启动子和章鱼碱合酶基因的增强子序列(Ellis等人，EMBO J.，6(11)3203-3208(1987))。
当增强子与LIS1启动子或LIS1嵌合启动子联合用于选定蛋白质的表达时，该增强子优选为启动子和相关的可操作性链接的(多个)多核苷酸或(多个)基因的编码区的起始密码子的上游。但是，也可以使用相对于相关的多核苷酸或(多个)选定基因的其它编码区而言不同增强子排列，以获得由该增强子赋予的有利特性。举例来说，可将增强子安置在启动子的5′(在该启动子内)在相关的(多个)多核苷酸或(多个)选定基因的编码区内(包括在可能存在的任何其它内含子序列内)或者该编码区的3′。
除增强子序列外，未翻译的前导序列(leader sequence)也可用在含有LIS1启动子或LIS1嵌合启动子的转化构造中。可用在该等构造中的优选前导序列包括那些具有可引导相关可操作性链接的(多个)多核苷酸或(多个)选定基因所附着的编码区的最佳表达的序列(即，包括优选一致的前导序列，其可增加或维持mRNA稳定性、预防翻译的错误起始、或促进更有效的翻译起始)的序列。所属领域的技术人员可容易地确定可用于转化构造中的未翻译前导序列。
根据本发明制备的转化构造也可含有充当3′末端处理的信号的3′末端DNA序列，并且允许通过可操作性链接到LIS1启动子或LIS1嵌合启动子的编码用序列而产生的mRNA的聚腺苷酰化作用。可与LIS1启动子或LIS1嵌合启动子联合使用的聚腺苷酰化区域包括(但不限于)那些来自为核酮糖-1，5-双磷酸酯羧基酶-加氧酶(rbcS)的小亚单元进行编码的基因的区域、来自根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefacien)的胭脂碱合酶基因的终止子(nos 3′末端)(Bevan等人，Nucleic Acids Research 11(2)369-385(1983))、用于自根瘤土壤杆菌的章鱼碱合酶基因T7转录的终止子，和来自马铃薯或西红柿的蛋白酶抑制剂I或II基因的3′末端。
本发明的转化构造可进一步采用转运肽和信号序列。与待表达的多核苷酸或选定基因的编码序列相接合的并可在翻译后自初始翻译产物移除且便利于蛋白质运输到或穿过细胞内或细胞外膜的序列被称为转运肽(这些肽便利于蛋白质转运到空胞、泡囊、质体和其它细胞内细胞器中)和信号序列(这些肽便利于运输到内质网、高尔基体和细胞膜外部中)(美国专利第5,728,925号描述了一种叶绿体转运肽及美国专利第5,510,471号描述了一种经优化的转运肽)。通过便利于蛋白运输到细胞内部和外部的隔室中，该等序列可通过保护基因产物免于解蛋白降解而增加其累积。该等序列也允许来自高表达基因的额外mRNA序列附着到该等基因的编码序列。因为由核糖体翻译的mRNA比不可翻译的mRNA更稳定，因此先于多核苷酸或基因而存在的可翻译mRNA可增加基因的mRNA转录的总体稳定性且因而增加多核苷酸或基因产物的合成。由于转运和信号序列通常在翻译后被从初始翻译产物中除去，所以该等序列的使用允许增加可能不出现在最终多肽中的额外翻译序列。我们进一步预期可能需要靶向特定的蛋白质以增强蛋白的稳定性(参阅美国专利第5,545,818号)。
本发明的LIS1启动子或LIS1嵌合启动子也可用于引导可操作性链接的可筛选标记基因的表达。可用在本发明中的可筛选标记基因的编码区实例包括(但不限于)下表1中所示的编码区。
表1
1Dellaporta等人Chromosome Structure and FunctionImpact of New Concepts，18thStadler Genetics Symposium，11263-383(1988).
2Sutcliffe，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75337-3741(1978).
3Ow等人，Science，234856-859(1986).
4Prasher等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.，126(3)1259-1268(1985).
5Sheen等人，Haseloff等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94(6)2122-2127(1997)；Reichel等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93(12)5888-5893(1996)；Tian等人，Plant Cell.Rep.，16267-271(1997)；WO 97/41228。
在另一实施例中，本发明涉及一种用于植物中选定蛋白质有效表达的方法和组合物。本发明的LIS1启动子或LIS1嵌合启动子可用于在任何类型的植物和植物部分如单子叶植物或双子叶植物中表达一选定蛋白质。其中可使用LIS1启动子或LIS1嵌合启动子的单子叶植物的实例包括(但不限于)石蒜科(葱属(Allium)、水仙属(Narcissus))；禾本科(Graninae或Poaceae)，(燕麦属(Avena)、大麦属(Horedum)、稻属(Oryza)、黍属(Panicum)、狼尾草属(Pennisetum)、早熟禾属(Poa)、甘蔗属(Saccharum)、黑麦属(Secale)、高梁属(Sorghum)、小麦属(Triticum)、玉米属(Zea))。其中可使用LIS1启动子或LIS1嵌合启动子的双子叶植物的实例包括(但不限于)夹竹桃科(Apocynaceae)(长春花属(Catharanthus))；紫菀科(Asteraceae)或菊科(Compositae)(紫菀属(Aster)、金盏花属(Calendula)、翠菊属(Callistephus)、菊苣属(Cichorium)、金鸡菊属(Coreopsis)、大丽花属(Dahlia)、菊属(Dendranthema)、杂色菊属(Gazania)、非洲菊(Gerbera)、向日葵属(Helianthus)、蜡菊属(Helichrysum)、莴苣属(Lactuca)、金光菊属(Rudbeckia)、万寿菊属(Tagetes)、百日菊属(Zinnia))；凤仙花科(Balsaminaceae)(凤仙花属(Impatiens))；秋海棠科(Begoniaceae)(秋海棠属(Begonia))；石竹科(Caryophyllaceae)(石竹类属(Dianthus))；藜科(Chenopodiaceae)(甜菜属(Beta)、皂荚(Spinada))；葫芦科(Cucurbitaceae)(西瓜属(Citrullus)、南瓜属(Curcurbita)、甜瓜属(Cucumis))；十字花科(Cruciferae)(庭荠属(Alyssum)、芸苔属(Brassica)、糖芥属(Erysimum)、紫罗兰属(Matthiola)、萝卜属(Raphanus))；龙胆科(Gentinaceae)(洋桔梗(Eustoma))；牻牛儿苗科(Geraniaceae)(天竺葵属(Pelargonium))；大戟科(Euphorbiaceae)(大戟属(Poinsettia))；唇形科(Labiatae)(鼠尾草属(Salvia))；豆科(Leguminosae)(大豆属(Glycine)、山黧豆属(Lathyrus)、苜蓿属(Medicago)、菜豆属(Phaseolus)、豌豆属(Pisum))；百合科(Liliaceae)(百合属(Lilium))；半边莲科(Lobeliaceae)(半边莲属(Lobelia))；锦葵科(Malvaceae)(秋葵属(Abelmoschus)、棉属(Gossypium)、锦葵属(Malva))；蓝雪科(Plumbaginaceae)(补血草属(Limonium))；花荵科(Polemoniaceae)(福禄考属(Phlox))；报春花科(Primulaceae)(仙客来属(Cyclamen))；毛茛科(Ranunculaceae)(乌头属(Aconitum)、银莲花属(Anemone)、耧斗菜属(Aquilegia)、驴蹄草属(Caltha)、翠雀属(Delphinium)、毛茛属(Ranunculus))；蔷薇科(Rosaceae)(蔷薇属(Rosa))；茜草科(Rubiaceae)(繁星花(Pentas))；玄参科(Scrophulariaceae)(天使花属(Angelonia)、金鱼草属(Antirrhinum)、倒地蜈蚣属(Torenia))；茄科(Solanaceae)(辣椒属(Capsicum)、番茄属(Lycopersicon)、烟草属(Nicotiana)、矮牵牛属(Petunia)、茄属(Solatium))；伞形科(Umbelliferae)(芹属(Apium)、胡萝卜属(Daucus)、欧防风属(Pastinaca))；马鞭草科(Verbenaceae)(马鞭草属(Verbena)、马樱丹属(Lantana))；堇菜科(Violaceae)(堇菜属(Viola))。
如先前简述，本发明提供一种用于在植物和植物部分中经选定蛋白质表达的LIS1启动子和LIS1嵌合启动子。依照本发明用于植物宿主细胞中表达的选定蛋白质的选择将取决于转化的目的。农作物转化的主要目的之一是增加植物商业上所要的、农艺上或园艺上重要的性状。这些性状包括(但不限于)昆虫抗性或耐性；疾病抗性或耐性(病毒、细菌、真菌)、颜色(花青甙(例如(但不限于)天竺葵色素、矢车菊色素、翠花素、芍药色素、锦葵色素、矮牵牛素和类似物)和/或类胡萝卜素(例如(但不限于)八氢番茄红素、六氢番茄红素、ζ-胡萝卜素、链孢红素、番茄红素、γ-胡萝卜素、β-胡萝卜素、α-隐黄素、β-隐黄素、角黄素、辣椒红素、辣椒玉红素、玉米黄素、堇菜黄素、新叶黄素、花药黄质、叶黄素、虾青素和类似物))、花香、花寿命等。
在本发明的另一实施例中，用相关的一个以上的多核苷酸和/或选定基因来执行受体植物细胞的转化。在单一转化事件中使用独特的转基因编码载体或者使用合并有两个或两个以上编码序列的单一载体也可提供来自于相关的一个或多个多核苷酸或选定基因的两个或两个以上外源编码区。举例来说，认为在会聚、发散或共线方向上带有bar和aroA表达单元的质粒尤其适用。如需要可采用任何描述的任何两个或两个以上转基因，例如，那些赋予昆虫、疾病(病毒、细菌、真菌)或颜色(花青甙例如(但不限于)天竺葵色素、矢车菊色素、翠花素、芍药色素、矮牵牛素和类似物)和/或类胡萝卜素(例如(但不限于)八氢番茄红素、六氢番茄红素、ζ-胡萝卜素、链孢红素、番茄红素、γ-胡萝卜素、β-胡萝卜素、α-隐黄素、β-隐黄素、角黄素、辣椒红素、辣椒玉红素、玉米黄素、堇菜黄素、新叶黄素、花药黄质、叶黄素、虾青素和类似物))、花香、花寿命的转基因。
在另一实施例中，为了将可操作性链接的(多个)多核苷酸或(多个)选定基因引入植物以用来表达RNA分子(转录)(它们影响植物显型但是未被翻译成蛋白质)的目的，可采用本发明的LIS1启动子或LIS1嵌合启动子。通过使用反义RNA、叫做核糖酶的RNA酶，或者通过产生能促进核糖核酸酶P介导的目标mRNA分子分裂的RNA转录可影响此一目的。反义RNA、核糖酶或核糖核酸酶P介导的目标mRNA分裂可用于减少或消除转化植物中天然或引入的植物基因的表达。
使用所属领域中已知的常规技术可将至少一个反义RNA分子的表达用于抑制目标分子的表达。更明确地说，本发明涵盖一种表达盒构造，其中本发明的启动子可操作性地链接到对一互补多核苷酸单元(例如反义RNA分子)进行编码的多核苷酸序列。此互补多核苷酸单元与目标分子的结合可是受抑制的。举例来说，如果目标分子是mRNA分子，那么RNA、互补多核苷酸单元的结合将导致杂交和目标蛋白质翻译的停滞。
或者，本发明的启动子可操作性地链接到编码核糖酶的多核苷酸序列。更明确地说，本发明涉及一种表达盒构造，其中本发明的启动子可操作性地链接到编码核糖酶的多核苷酸序列。在所属领域中已知可设计该等核糖酶以表达针对mRNA分子中特定目标序列的核酸内切酶活性。举例来说，通过烟草原生质体中的核糖酶实现了新霉素磷酸转移酶基因表达的高达100％抑制(参阅Steinecke等人，EMBO J.，111525(1992))。在本发明中，用于核糖酶的合适的目标RNA分子的实例包括mRNA种类，其编码在植物生化途径中发现的生物合成酶。
在另一实施例中，本发明的启动子可用于引导能促进核糖核酸酶P介导的目标mRNA分子分裂的RNA分子(转录)的产生。更具体地说，本发明进一步涵盖一种表达盒构造，其中本发明的启动子引导能促进核糖核酸酶P介导的目标mRNA分子分裂的RNA转录的产生。在此方法之下，可构建一外部指导序列用来将内源核糖酶、核糖核酸酶P引导到一特定种类的mRNA，其随后通过细胞核糖酶进行分裂(参阅美国专利第5,168,053号；Yuan等人，Science，2631269(1994))。
本发明进一步涉及LIS1启动子或LIS1嵌合启动子可用于引入至少一个多核苷酸或经选定基因以产生转基因植物，这些转基因植物经由共抑制而具有天然基因产物的减少的表达。如在烟草、西红柿和矮牵牛花中所示(Goring等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，881770-1774(1991)，Smith等人，Mol.Gen.Genet.，224447-481(1990)，Napoli等人，Plant Cell，2279-289(1990)，van der Krol等人，Plant Cell，2291-299(1990))，天然基因正义转录的表达可以与对反义基因所观察到的相似方式减少或消除天然基因的表达。所引入的基因可对全部或部分目标天然基因进行编码；但是，为减少天然基因水平起见不需要它的翻译。
本发明进一步涵盖使用所属领域中已知的一种或多种分析以确定或测定转基因表达的功效。举例来说，分析可用于测定当与各种不同的增强子序列、终止子或其它调控元素联合使用时，LIS1启动子或LIS1嵌合启动子在引导植物的至少一朵花中蛋白质表达的功效。分析也可用于测定LIS1启动子或LIS1嵌合启动子的各种缺失突变体在引导蛋白质表达中的功效。
待分析的生物样品可以是使用所属领域中已知的分子生物技术从任何植物材料的细胞中分离出来的多核苷酸(Sambrook等人，在Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989中)。该多核苷酸可以是染色体组DNA或经分馏的或完整的细胞RNA。使用RNA时，若合适，可将其转变为DNA。
可用在本发明中的各种分析的实例包括荧光原位杂交(“FISH”)、直接DNA定序、脉冲场凝胶电泳(“PFGE”)分析、RNA或DNA凝胶墨点分析、单链构象分析(“SSCA”)、核糖核酸酶保护分析、等位基因特异性寡核苷酸分析法(“ASO”)、点墨分析(dot blotanalysis)、变性梯度凝胶电泳和限制性片段多态性分析(“RFLP”)。
为了测定用以表达特定转基因的功效，要提纯并量化由该转基因所表达的多肽。提纯蛋白质的技术在所属领域中是已知的。这些技术包括(但不限于)离子交换色谱法、亲合色谱法、排除色谱法、凝胶电泳、等电子聚焦、快速蛋白质液相色谱法或高性能液相色谱法。此外，免疫程序也可用于蛋白质探测。方法包括(但不限于)酶联免疫吸附分析(“ELISA”)、西方墨点和放射免疫分析(“RIA”)。
与本发明相联系而使用的适用于植物转型化的方法包括任何可将DNA引入宿主细胞的方法，其包括(但不限于)在下表2中所述的方法。
表2
可培养通过任何上述转化技术转化的植物细胞以再生具有转化显型的整个植物。这些再生技术依赖于组织生长培养基中某些植物激素的操纵，通常依赖于标记基因，其与LIS1启动子或LIS1嵌合启动子和来自于相关的多核苷酸或选定基因的编码区一起被引入。在Evans等人，Protoplasts Isolation and Culture，Handbook of Plant Cell Culture，第124-176页，Macmillan Publishing Company，New York，1983；和Binding；Regeneration ofPlants，Plant Protoplasts，第21-73页，CRC Press，Boca Raton，1985中描述了从经培养的原生质体的植物再生。也可以从植物愈伤组织、外植体、器官或其部分获得再生。该等再生技术在Klee等人的Ann.Ref.of Plant Phys.38467-486(1987)中得以广泛描述。
本发明的方法尤其适用于以不被自然发现的方式并此情况下将各种相关的多核苷酸或选定基因并入转化植物。详言之，可不时地或者以天然植物的非特征性数量对各种多核苷酸或选定基因进行表达。
所属领域的技术人员公认在转化构造被稳定地并入到转基因植物中并证明具有可操作性之后，可通过有性交叉将其引入其它植物。可使用若干标准的繁殖技术中的任何一个，这取决于待交叉的种类。
现在通过举例且不带限制性的方式给出本发明的实例。
实例1pBHX质粒pBHX109分离由与GFP基因(可从哥伦布的Arabidopsis Biological Resource Center，OH得到的质粒pCD3-327中所含有的sm-RSGFP型式)相融合的Arabidospis UBQ3聚合泛素基因(1.3kb)的含启动子区域和含nos polyA信号区域组成的2.4Kb Hind III-EcoR I片段。然后将此片段连接到先前已用Hind III和EcoR I消化的T-DNA二元载体以产生pBHX109。
PBHX113分离由与GFP基因(可从哥伦布的Arabidopsis Biological Resource Center，OH得到的质粒pCD3-327中所含有的sm-RSGFP型式)相融合的Clarkia brewerii LIS1基因的含启动子区域(在pBHX103中所发现的相同区域)和含nos polyA信号区域组成的Hind III-EcoR I片段。然后将此片段连接到先前已用Hind III和EcoR I消化的T-DNA二元载体以产生pBHX113。
pBHX94从密歇根大学(University of Michigan)获得了含有Clarkia brewerii LIS1基因5′侧区的质粒。使用引物BHX30CCAAGCTTATCTAATAATGTATCAAAATC(SEQ ID NO3)和BHX31GGCCATGGTTGTCTTGTTTAAGGTGG(SEQ ID NO5)通过PCR合成了含有该LIS1 5′侧区的～1kb片段。设计这些引物以使在一个末端处且在3′末端的5′未翻译前导区内的5′侧区退火。用限制性酶Hind III和Nco I来消化该PCR产物，这些酶分别分裂在该片段的5′末端和3′末端。该Nco I位点与LIS1蛋白编码区的起始密码子重叠。对该经消化的片段进行凝胶提纯并随后在框内(in-frame)将其融合到含有质粒的无启动子的gusA::nos转基因(先前用Hind III和Nco I消化)以产生LIS1::gusA::nos转基因(命名为pBHX94)。
pBHX99用Hind III和EcoR I消化质粒pBHX94以解放含有LIS1::gusA::nos转基因的片段。然后将此片段连接进先前用Hind III和EcoR I消化的T-DNA二元载体以产生pBHX99。
pBHX103从密歇根大学获得了含有Clarkia brewerii LIS1基因5′侧区的质粒。使用引物BHX30CCAAGCTTATCTAATAATGTATCAAAATC(SEQ ID NO3)和BHX36GGCCATGGTTGTCTTGTTTAAGGTGG(SEQ ID NO4)通过PCR合成含有LIS1 5′侧区的～1kb片段。设计这些引物以使在一个末端处且在3′末端的5′未翻译前导区内的5′侧区退火。用限制性酶Hind III和Sma I来消化该PCR产物，这些酶可分别分裂该片段的5′末端和3′末端。对该经消化的片段进行凝胶提纯并随后将其插入到含有多克隆位点区(MCS)接着是含nos polyA信号区的经Hind III-和Sma I-消化的质粒，以产生LIS1::MCS::nos转基因(命名为pBHX103)。
pBHX107将来自质粒pATC921(含有crtB基因，具有与crtB蛋白编码区的N末端相融合的rbsS转运肽)的1.5kb Hinc II片段以正义方向插入到位于质粒pBHX103的LIS1启动子与nos片段之间的Sma I位点以产生pBHX107。
pBHX112用Hind III和EcoR I消化的质粒pBHX107以解放含有LIS1::crtB::nos转基因的片段。然后将该片段连接到先前已用Hind III和EcoR I消化的T-DNA二元载体中以产生pBHX112。
实例2对含有LIS1启动子或组成性UBQ3启动子的质粒所转化的转基因矮牵牛花株中的基因表达的评估为使用LIS1启动子来评估花组织中的基因表达，用LIS1::GFP::nos(pBHX113)或UBQ3::GFP::nos(pBHX109)构造来转化“米切尔(Mitchell)”矮牵牛花。UBQ3是所属领域中为人熟知的组成性启动子。产生矮牵牛花转化株。一旦在温室中建立了有花植物，就使用自荧光显微镜产生的蓝光来评估每个植物样本花的GFP表达。采用主观分级制(subjective rating system)，0表明无可见表达，最高的4表示最高表达。
结果显示在下表3中。LIS1引导的GFP表达在花瓣和花冠喉(throat)花组织中最为明显。所测试的LIS1和UBQ3转基因植物中，仅两株含有LIS1启动子的植物在雌蕊组织中具有GFP表达。UBQ3引导的GFP表达在整个花组织中更为一致，正如组成型启动子所预期的那样。结果显示了LIS1启动子与UBQ3组成性启动子在花瓣组织中的可比GFP表达。
表3GFP表达
实例3用对含有来自CaMV的LIS1启动子或35S启动子的质粒所转化的转基因矮牵牛花株中的基因表达的评估生成了十一个(11)含有质粒LIS1::gusA::nos(pBHX99)的转基因“Dreams White”矮牵牛花株(“Dreams White”可购自PanAmerican Seed Company，622 Town Road，WestChicago，IL)和三个含有35S::gusA::nos构造(pBI121)的转基因植物株。一旦在温室中建立了开花植物，就用5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖醛酸、环己基铵盐溶液(X-gluc)来以组织化学方法为来自每株植物的样本花和嫩叶着色并对其评估在各组织中的GUS表达(参看下表4)。采用主观分级制，0表明无可见表达，最高的3表示最高表达。
在下表4中，几个植物株显示了花优选的表达。相反，所有三个(3)35S::gusA::nos(pBI121)植物株都显示了在所有测试的组织中的中到高GUS表达(参看下表4)。这些结果显示LIS1::gusA::nos(pBHX99)转基因植物株中有一些展示了在叶子组织中的GUS表达，表明了在接入矮牵牛花基因组的特定区域后，该LIS1启动子可被不适当地表达(所谓的“位置效应”)。但是，所识别的大部分(六个(6))LIS1::gusA::nos(pBHX99)植物株显示了在花瓣和其它花组织中的中到高表达，而在叶子中不具有可见GUS表达。照片显示在图2中，显示了在含有LIS1::gusA::nos或35S::gusA::nos(pBI121)构造的转基因矮牵牛花株之间GUS表达的差别。
表4GUS表达
为获得在LIS1::gusA::nos(pBHX99)转化植物中相比35S::gusA::nos(pBI121)转化株的GUS活性的定量测量，用甲基伞形基-β-D-葡糖苷酸(MUG)作为基质来执行利用来自各种植物组织的无细胞粗提取物的GUS表达的荧光探测。实行双重分析，且结果显示在表5中。
全部LIS1::gusA::nos转化植物显示了在花瓣中高于在对照物中的GUS表达，并且除一株植物(1700-1-6)以外，比在35S::gusA::nos转化植物的任何花瓣中的表达都高。此外，对于所有LIS1::gusA::nos转化植物而言，花瓣中的GUS表达显著高于叶子和花萼组织。矮牵牛花株1700-1-14A展示了在花瓣组织中的最高表达，其具有2160.4+/-626.3nmol/min/g[fw]的水平。此水平的GUS活性比CaMV 35S RNA启动子(已知双子叶植物中极具活性的启动子)高28倍。由此可推断该LIS1启动子引导矮牵牛花花瓣中的最高水平表达。
表5GUS表达nmol/min/g(fw)+/-标准偏差
为说明LIS1启动子提供了在其它矮牵牛花品种中的花优选基因表达，测量了在“Mitchell”矮牵牛花的转化株中的GUS活性。执行了双重分析，且结果显示在下表6中。尽管相比转基因“Dreams White”的花瓣而言LIS1::gusA::nos“Mitchell”矮牵牛花的花瓣中的总体GUS表达更低，但是趋势是相同的。在LIS1::gusA::nos转基因“Mitchell”矮牵牛花花瓣中的GUS表达在61到419nmol/min/g[fw]范围内变化，而35S::gusA::nos植物株的花瓣中达到了63nmol/min/g[fw]的水平，这表明LIS1::gusA::nos转基因“Mitchell”矮牵牛花花瓣中基因表达水平与对35S::gusA::nos植物株的表达一样高或更高(比99A-2700-1-5植物株高6倍)。相反，在叶子和花萼组织中，LIS1::gusA::nos转基因植物株中的GUS表达水平分别在0.7到7.3和1.9到20.5nmol/min/g[fw]范围变化。35S::gusA::nos转基因植物株中的GUS表达在叶子组织中达到了104nmol/min/g[fw]且在花萼组织中达到了93.9nmol/min/g[fw]。由于35S是已知的组成性启动子，因此预期着在35S::gusA::nos转基因植物株的不同组织中GUS表达的一致性。“Dreams Whire”和“Mitchell”矮牵牛花在LIS1::gusA::nos转基因植物株中获得的比较结果清楚地显示了用LIS1启动子的花优选的表达。
因此，针对GUS活性的组织化学分析和荧光分析是一致的且表明该LIS1启动子能引导矮牵牛花花组织中的高水平基因表达。
表6GUS表达nmol/min/g[fw]+/-标准偏差
实例4对含有LIS1启动子的质粒所转化的转基因矮牵牛花的花部分和正开放的花瓣中的基因表达的评估将含有质粒LIS1::gusA::nos的命名为1700-1-14A的转基因“Dreams White”识别为在花瓣组织中具有最高GUS表达的植物株(参看上表5)。将此植物株进一步用于研究中以检测如通过花蕾或花长所测定的花龄对GUS表达的影响并测定在成熟花的特定花部分中的GUS表达。
对从花萼到花瓣边沿测量为2到5cm长中选择出来的1700-1-14A花测量了花瓣中的GUS活性。花蕾关闭阶段通常是2cm，而5cm是完全开放的花。下表7中所示的结果揭示从花蕾到成熟花中GUS表达有174倍的增加，表明随着花的成熟，GUS表达增强。
表7
对1700-1-14A完全开放的花测定了花部分中的GUS活性。所测的花部分包括花瓣尖(末梢)、花瓣底、花药/花粉和雌蕊。实行双重分析，且结果显示在下表8中。在所有花组织中观察到了GUS表达，以在雌蕊中的GUS表达最高。雌蕊GUS表达比在末梢花瓣组织中高14倍。因此，可推断LIS1启动子引导整个矮牵牛花花组织中的高水平表达。
表8
实例5对含有LIS1启动子的质粒所转化的转基因金盏花株中的基因表达的评估为测定LIS1启动子是否能引导在第二异种植物种类中的高水平GUS表达，用LIS1::gusA::nos(pBHX99)构造来转化金盏花(万寿菊)植物PanAmerican Seed专有繁殖株13819并且回收一个被鉴别为99A-3300-1-10株的转化株。对此植物株的不同植物组织执行荧光分析以探测GUS表达。如在LIS1::gusA表达的矮牵牛花中所发现的，GUS表达(nmol/min/g[fw])在花组织中较高，但在花萼和叶子中不高。这些结果表明LIS1启动子引导金盏花中花优选的基因表达。
利用探测GUS活性的荧光分析来评估用LIS1::gusA::nos(pBHX99)转化的PAS繁殖株13819的其它转基因植物。也评估了来自上述与对照父本PanAmerican Seed专有的繁殖株13819所交叉的99A-3300-1-10株的后裔。实行双重分析，且结果显示在下表9中。在包括雌蕊、花瓣和正发展种子的金盏花的花组织中观察到了相对高水平的由LIS1引导的GUS表达。在雌蕊中观察到高达351nmol/min/g[fw]的GUS表达。此水平可比得上在“Mitchell”矮牵牛花的花瓣组织中所观察到的LIS1引导的GUS表达。在叶子组织中观察到更低水平表达或无表达。在所测试的六个花托的两个中，观察到了高水平表达。
使用转基因99A-3300-1-10的交叉后的后裔99A-10-2、99A-10-3、99A-10-17和99A-10-18的分析表明转基因在性别上可遗传。另外，该等后裔中的两个(99A-10-17和99A-10-18)在所观察到的最高花瓣表达当中。
花组织中LIS1引导的GUS表达水平高于在对照植物的花中观察到的水平，并且除所测试的三个植物株以外，花组织中LIS1引导的GUS表达高于35S::gusA::nos转化植物。因此，可推断LIS1启动子在金盏花中是可遗传的并且可引导金盏花以及矮牵牛花花组织中的高水平转基因表达。
表9GUS表达nmol/min/g[fw]
实例6对含有LIS1启动子和crtB的质粒转化的转基因矮牵牛花株的评估分析来自用含有LIS1::crtB::nos的pBHX112转化的两株“Mitchell”矮牵牛花植物的花，以确定基因表达是否局限于特定的花载体。crtB基因对酶八氢番茄红素合酶进行编码，该酶产生八氢番茄红，是一种早期在类胡萝卜素生物合成途径中发现的无色类胡萝卜素中间物。将植物鉴别为112-3200-1-45和112-3200-1-59，并将花分成三部分花瓣、上花冠喉和下花冠喉。从每部分提取总RNA并实行RNA凝胶墨点分析。显示在图3中的结果表明crtB mRNA以中等水平呈现在花瓣和上花冠喉组织中并在较少程度上呈现在下花冠喉组织中，证明可探测在转录水平的基因表达。
为进一步证实花瓣组织中的基因活性，使用用LIS1::crtB::nos(pBHX112)构造转化的“Mitchell”矮牵牛花株来实行HPLC分析。为了HPLC分析，在进行花瓣组织提取程序之前，实行用于在干燥植物材料中提取胡萝卜素和叶黄素的法定方法(参阅，OfficialMethods of Analysis(1980)第13版，AOAC，Arlington，VA，sec.43.018-43.023)。提取过程中未使组织皂化。
HPLC设备包含装配有冷冻自动取样器、柱状加热器的和Waters Photodiode Array996探测器(Waters Corp.，Milford，MA)的Alliance 2690。用具有相同材料保护柱的3μm、2.0×150mm的YMC C30柱得以分离。从新泽西的萨默维尔的ICC Indofine Chemicals并从丹麦的Horsholm的DHI-Water&Environment得到标准。将干燥样品再悬浮在甲基第三丁基醚和甲醇中得到200微升的总体积并过滤。用梯度法分离类胡萝卜素。初始梯度条件为在每分钟0.4微升流速的90％甲醇∶5％水∶5％甲基第三丁基醚。从0到15分钟，流动相从初始条件变为80甲醇∶5水∶15甲基第三丁基醚，从15到60分钟变为20甲醇∶5水∶75甲基第三丁基醚。对于随后的10分钟，该流动相恢复到初始条件并使该柱平衡额外15分钟。将柱温维持在27℃。注射液为10μL。在450nm时将峰面积用作总面积的百分数来表示下表10中所示的类胡萝卜素的值。以光谱特征为基础鉴别八氢番茄红素，且从最大图块测定八氢番茄红素面积。数据表示成标准化的峰面积且括号中的数字表示每种类胡萝卜素贡献给总的类胡萝卜素峰面积的百分数。
花瓣组织中LIS1启动子活性所观察的在β胡萝卜素水平上相比对照物而言超过10倍的增加中是明显的。在转基因中也观察到了八氢番茄红素的存在，其在对照花瓣组织中未能探测到。玉米黄素和叶黄素含量与对照物无显著不同。
表10
平行的试验中，同样的杂交缓反应是将DNA用EB缓冲液10倍和100稀释以检测该技术的灵敏度。
实施例36.2对照组对照样品同时按照下列方式制备A.比较HLA-DR试剂盒将10μl按照实施例5描述的方法用PCR扩增得到的DNA与20μl对-Bio-EG3-PDAM在60℃培养30min。标记后DNA用QIAquick柱纯化，将最终洗脱下来的物质溶解到50μl EB缓冲液中。将45μl这种洗脱液用4.5μl试剂R4在室温下培养5min使之变性，然后用4.5μl试剂R5中和。混合物中加入450μl杂交缓冲液R6和45μl检测寡核苷酸。将100μl上述制备液加入到试剂盒提供的Strip R1的阳性对照孔(被扩增基因的一致序列捕获)中，或链亲和素包被的Combiplate 8平板中，或者对照Maxisorb平板中。
B.杂交所用DNA不与特异性探针杂交将10μl按照实施例5描述的方法用PCR扩增得到的DNA与20μl对-Bio-EG3-PDAM在60℃培养30min。样品的其他处理方法与上面实施例A描述的相同。
C.无DNA对照将10μl试剂R6(杂交缓冲液)和100μl试剂R7(检测寡核苷酸)加入到试剂盒提供的Strip R1的阳性对照孔中，或链亲和素包被的Combiplate 8平板中，或者对照Maxisorb平板中。
将上述所有试验中的Strips在37℃培养1h 30min，然后用100μl PBS Tween缓冲液(试剂盒的Color 0 HLA试剂)洗涤三次，加入100μl显色试剂(Color 2试剂，PBS pH7.0；1％ Tween，0.2g/l BND；0.01g/l Ciproflaxacin)在暗处培养20min可以看到特异性检测探针的存在，然后用50μl H2SO2(1.8N Color 3试剂)终止反应。然后测量反应介质在492nm处的吸光度值。
结果
<p>
a112A-3200-1-53×6923-1b112A-3200-1-45×Carpet Butter Cream实例7在用含有BAMT启动子和gusA的质粒转化的转基因矮牵牛花株中的GUS表达的评估为使用BAMT启动子评估花组织中的基因表达，用BAMT::gusA::nos构造转化“Mitechell”矮牵牛花。苯甲酸羧甲基转移酶BAMT是在苯甲酸甲酯生物合成中最后产物酶，苯甲酸甲酯是一种挥发性酯，已知是在金鱼草花中最丰富的香味化合物。生成矮牵牛花转化株。一旦在温室中建立了开花植物，就用X-gluc溶液来着色来自十七株个体植物的样本花和嫩叶以探测GUS活性。采用主观分级制，0表明无可见表达，最高的4表示最高表达。
如下表12所示，对于任何矮牵牛花转化株没有在花瓣组织中探测到GUS表达。在金鱼草中，大多数BAMT基因活性是在花冠的上下叶片中发现(Dudareva等人，The PlantCell，12949-961(2000))。因此，不能预测从花瓣组织中所表达的基因取得的启动子可用于引导外来基因的花瓣表达。
表12GUS表达
*可能的弱表达**u未分析所参考的所有文献和专利以引用的方式并入本文。
本专利借助于前文的描述和实例得以说明。欲将前文的描述作为非限制性说明，因为对所属领域的技术人员而言许多变更是显而易见的。欲借此将所有该等变化包括在随附权利要求的范围和精神内。
在不发散本发明概念和范围的情况下，可对本发明方法的组合物、操作和排列进行改变。
序列表<110>鲍尔园艺公司(Ball Horticulturai company)<120>用于表达花组织中转基因的LIS启动子<130>BAL6019P0391PCT<150>US60/361，192<151>2002-03-01<160>5<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>3708<212>DNA<213>Clarkia brewerii<220>
<221>misc_feature<222>(448)..(448)<223>N＝A或C或G或T/U<220>
<221>misc_feature<222>(472)..(472)<223>N＝A或C或G或T/U<400>1aaatatccac aaaatttatt ttatctaata atgtatcaaa atctaaaata aaatttaggt60taagaagtgg gtgcaatttg ttaggcaccc acttcttaat gatccatgtg taatgtttgt120taggcacgct aagctggagt gcacattatt tgttggcttt gtcttgatgt ggtaatttta180tttttgccaa attatcacgt atatttgccc gatcgggcat tctaatatct aatctaaaaa240tataatttta agttagataa taatatctta cgaaataaac atttataata tttaaaacta300atattaactt ttgtccttca aatatttatt atcgtgtctt acgtaacaca cgaggtgatt360atatataaat ttaaaacgaa tcacagaaaa atttatgtca ttaaataatt attgatatat420attttattta atttactata atattatnta ctcgaatcat aattttttta angtattttg480atttacaaac ggtttatttc aagtaaaaaa cattttggaa tgaacatgga ttatataaca540
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<221>misc_feature<222>(428)..(428)<223>N＝A或C或G或T/U
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<221>misc_feature<222>(452)..(452)<223>N＝A或C或G或T/U<400>2ttatctaata atgtatcaaa atctaaaata aaatttaggt taagaagtgg gtgcaatttg60ttaggcaccc acttcttaat gatccatgtg taatgtttgt taggcacgct aagctggagt120gcacattatt tgttggcttt gtcttgatgt ggtaatttta tttttgccaa attatcacgt180atatttgccc gatcgggcat tctaatatct aatctaaaaa tataatttta agttagataa240taatatctta cgaaataaac atttataata tttaaaacta atattaactt ttgtccttca300aatatttatt atcgtgtctt acgtaacaca cgaggtgatt atatataaat ttaaaacgaa360tcacagaaaa atttatgtca ttaaataatt attgatatat attttattta atttactata420atattatnta ctcgaatcat aattttttta angtattttg atttacaaac ggtttatttc480aagtaaaaaa cattttggaa tgaacatgga ttatataaca tttcgaacaa gcgtacacca540taagaagtta attaacaata atgtgtatat gtttgtttaa tatattaatt tagaaaatga600atttatatat gatggtcgag tgattgataa tataatacaa atatacaagt ttcatttaat660atgcgcgggt tagtggctag ttcaaattac ttcatgagct tttctattca aacatttact720attgcataag ctgacccaac tcttgtatta acccttataa atttaaatga tcagtttgac780catgacagat tatattaatt ccgattagat taattaattt attataattg gcaattaaaa840ctcatttatt atatattatg tatagtaata aaataattga tgatgttagg atggaaggga900cgggagatga gtgcagtaat taaattaagg ccacatccta tcatatccca gtctataaat960acagatccag atccacttca tataagcaag ctatcttccc agaaaaccaa accaccttaa1020
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权利要求
1.一种编码启动子的经分离的多核苷酸，其包含选自由以下各序列组成的群组的序列SEQ ID NO2及在严格条件下与SEQ ID NO2杂交的序列及其片段和变体。
2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中该等严格条件具有低严格性。
3.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中该等严格条件具有高严格性。
4.一种经分离的多核苷酸，其包括在植物的至少一朵花中能引发转录的序列，其中所述序列是选自由以下各序列组成的群组SEQ ID NO2及在严格条件下与SEQ ID NO2杂交的序列及其片段和变体。
5.根据权利要求4所述的多核苷酸，其中该等严格条件具有低严格性。
6.根据权利要求4所述的多核苷酸，其中该等严格条件具有高严格性。
7.一种能够引导植物花中转录的经分离的启动子，其中所述启动子包含具有选自由以下各序列组成的群组的序列的多核苷酸SEQ ID NO2及在严格条件下与SEQ ID NO2杂交的序列及其片段和变体。
8.根据权利要求7所述的多核苷酸，其中该等严格条件具有低严格性。
9.根据权利要求7所述的多核苷酸，其中该等严格条件具有高严格性。
10.一种表达盒，其包含根据权利要求7所述的启动子和可操作性地与所述启动子链接的多核苷酸序列，其中所述启动子能够引发所述多核苷酸序列在用所述表达盒转化的植物的花中的转录和表达。
11.根据权利要求10所述的表达盒，其中该多核苷酸序列以正义方向插入该表达盒中。
12.根据权利要求10所述的表达盒，其中该多核苷酸序列以反义方向插入该表达盒中。
13.一种表达载体，其包含根据权利要求10所述的表达盒。
14.一种植物或植物部分，其用根据权利要求10所述的表达盒稳定地加以转化。
15.根据权利要求14所述的植物部分，其中该等植物部分是选自由以下各部分组成的群组细胞、原生质体、细胞组织培养物、愈伤组织、细胞块、胚芽、花粉、胚珠、花瓣、花柱、雄蕊、叶子、根、根尖及花药。
16.根据权利要求14所述的植物，其中该植物是单子叶植物。
17.根据权利要求16所述的植物，其中所述单子叶植物是选自由以下各植物组成的群组石蒜科、禾本科(Graminae及Poaceae)。
18.根据权利要求14所述的植物，其中该植物是双子叶植物。
19.根据权利要求18所述的植物，其中所述双子叶植物是选自由以下各植物组成的群组夹竹桃科、紫菀科、菊科、凤仙花科、秋海棠科、石竹科、藜科、葫芦科、十字花科、龙胆科、牻牛儿苗科、大戟科、唇形科、豆科、百合科、半边莲科、锦葵科、蓝雪科、花荵科、报春花科、毛茛科、蔷薇科、茜草科、玄参科、茄科、伞形科、马鞭草科及堇菜科。
20.根据权利要求14所述的植物种子，在其基因组内包含所述表达盒。
21.一种包含嵌合启动子和多核苷酸序列的表达盒，其中所述多核苷酸序列可操作性地与所述嵌合启动子链接，且其中所述嵌合启动子包含(a)在植物花中具有启动子优选活性的第一多核苷酸，其中所述多核苷酸具有选自由以下各序列组成的群组的序列SEQID NO2及在严格条件下与SEQ ID NO2杂交的序列及其片段和变体；及(b)至少一第二多核苷酸序列，其中所述多核苷酸能够引发在植物中多核苷酸序列的转录。
22.根据权利要求21所述的表达盒，其中该嵌合启动子包含在植物的花中具有启动子优选活性的至少一第二多核苷酸序列。
23.根据权利要求21所述的表达盒，其中该嵌合启动子包含在植物花中具有启动子优选活性的第二多核苷酸序列。
24.根据权利要求21所述的表达盒，其中该嵌合启动子包含(a)在植物的花中具有启动子优选活性的第一多核苷酸，其中所述多核苷酸具有选自由以下各序列组成的群组的序列SEQ ID NO2及在严格条件下与SEQ ID NO2杂交的序列及其片段和变体；及(b)在植物的花中具有启动子优选活性的第二多核苷酸，其中所述第二多核苷酸具有选自由以下各序列组成的群组的序列SEQ ID NO2及在严格条件下与SEQ ID NO2杂交的序列及其片段和变体。
25.根据权利要求21所述的表达盒，其中该可操作性地与嵌合启动子链接的多核苷酸序列以正义方向插入该表达盒中。
26.根据权利要求21所述的表达盒，其中该可操作性地与嵌合启动子链接的多核苷酸序列以反义方向插入该表达盒中。
27.一种表达载体，其包含根据权利要求21所述的表达盒。
28.一种植物或植物部分，其用根据权利要求21所述的表达盒稳定地加以转化。
29.根据权利要求28所述的植物部分，其中该等植物部分是选自由以下各部分组成的群组细胞、原生质体、细胞组织培养物、愈伤组织、细胞块、胚芽、花粉、胚珠、花瓣、花柱、雄蕊、叶子、根、根尖及花药。
30.根据权利要求28所述的植物，其中该植物是单子叶植物。
31.根据权利要求30所述的植物，其中所述单子叶植物是选自由以下各植物组成的群组石蒜科、禾本科(Graninae及Poaceae)。
32.根据权利要求28所述的植物，其中该植物是双子叶植物。
33.根据权利要求32所述的植物，其中所述双子叶植物是选自由以下各植物组成的群组夹竹桃科、紫菀科、菊科、凤仙花科、秋海棠科、石竹科、藜科、葫芦科、十字花科、龙胆科、牻牛儿苗科、大戟科、唇形科、豆科、百合科、半边莲科、锦葵科、蓝雪科、花荵科、报春花科、毛茛科、蔷薇科、茜草科、玄参科、茄科、伞形科、马鞭草科及堇菜科。
34.根据权利要求28所述的植物的种子，在其基因组内包含所述表达盒。
35.一种用DNA分子稳定地转化的转基因植物细胞，该DNA分子包含能够引发植物的花中转录的启动子，其中所还启动子包含具有选自由以下各序列组成的群组的序列的多核苷酸SEQ ID NO2及在严格条件下与SEQ ID NO2杂交的序列及其片段和变体。
36.根据权利要求35所述的转基因植物细胞，其中DNA分子进一步包含可操作性地与该启动子链接的选定编码区。
37.根据权利要求36所述的转基因植物细胞，其中该选定编码区位于正义方向。
38.根据权利要求36所述的转基因植物细胞，其中该选定编码区位于反义方向。
39.根据权利要求35所述的转基因植物细胞，其中该等严格条件具有低严格性。
40.根据权利要求35所述的转基因植物细胞，其中所该等严格条件具有高严格性。
41.根据权利要求36所述的转基因植物细胞，其中所述选定编码区对以下进行编码抗昆虫性蛋白、抗细菌疾病性蛋白、抗真菌疾病性蛋白、抗病毒疾病性蛋白、花青甙生物合成酶、类胡萝卜素生物合成酶、花香生物合成蛋白、可筛选的标记蛋白或提升花寿命的蛋白。
42.根据权利要求36所述的转基因植物细胞，其中所述选定编码区对选自由以下可筛选标记蛋白组成的群组进行编码β-葡糖苷酸酶、β-内酰胺酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、水母发光蛋白和绿色荧光蛋白。
43.根据权利要求36所述的转基因植物细胞，其中所述选定编码区对产生以下化合物的花青甙生物合成酶进行编码天竺葵色素、矢车菊色素、翠花素、芍药色素、锦葵色素和矮牵牛素。
44.根据权利要求36所述的转基因植物细胞，其中所述选定编码区对产生以下化合物的类胡萝卜素生物合成酶进行编码八氢番茄红素、六氢番茄红素、ζ-胡萝卜素、链孢红素、番茄红素、γ-胡萝卜素、β-胡萝卜素、α-隐黄素、β-隐黄素、角黄素、辣椒红素、辣椒玉红素、玉米黄素、堇菜黄素、新叶黄素、花药黄质、叶黄素和虾青素。
45.一种在转基因植物的花中表达选定蛋白的方法，该方法包括以下步骤(a)获得包含选定编码区的表达载体，该编码区可操作性地与能够引发植物花中转录的启动子链接，其中所述启动子包含具有选自由以下各序列组成的群组的序列的多核苷酸SEQ ID NO2及在严格条件下与SEQ ID NO2杂交的序列及其片段和变体；(b)用所述载体转化受体植物细胞；及(c)再生一表达所述受体植物细胞的所述选定蛋白的转基因植物。
46.根据权利要求45所述的方法，其中该选定编码区位于正义方向。
47.根据权利要求45所述的方法，其中该选定编码区位于反义方向。
48.根据权利要求45所述的方法，其中该等严格条件具有低严格性。
49.根据权利要求45所述的方法，其中该等严格条件具有高严格性。
50.根据权利要求45所述的方法，其中所述转化步骤包括选自由以下各方法组成的群组中粒子枪法、聚乙二醇介导的原生质体的转化、电穿孔法和土壤杆菌介导的转化。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述转化步骤包括粒子枪法。
52.根据权利要求50所述的方法，其中所述转化步骤包括聚乙二醇介导的原生质体的转化。
53.根据权利要求50所述的方法，其中所述转化步骤包括电穿孔法。
54.根据权利要求50所述的方法，其中所述转化步骤包括土壤杆菌介导的转化。
55.根据权利要求45所述的方法，其中所述受体植物细胞是来自单子叶植物。
56.根据权利要求55所述的方法，其中该单子叶植物是选自由以下各植物组成的群组石蒜科、禾本科(Graninae及Poaceae)。
57.根据权利要求45所述的方法，其中所述受体植物细胞是来自双子叶植物。
58.根据权利要求57所述的方法，其中该双子叶植物是选自由以下各植物组成的群组夹竹桃科、紫菀科、菊科、凤仙花科、秋海棠科、石竹科、藜科、葫芦科、十字花科、龙胆科、牻牛儿苗科、大戟科、唇形科、豆科、百合科、半边莲科、锦葵科、蓝雪科、花荵科、报春花科、毛茛科、蔷薇科、茜草科、玄参科、茄科、伞形科、马鞭草科和堇菜科。
全文摘要
本发明涉及一种衍生自S－芳樟醇合酶基因的经分离的启动子，其可用于向植物的至少一朵花中的至少一个经可操作性链接的多核苷酸或选定的基因授予高水平的表达。
文档编号C12N9/00GK1639345SQ03805029
公开日2005年7月13日 申请日期2003年2月28日 优先权日2002年3月1日
发明者兰德尔·豪普特曼, 艾伦·布洛尔斯, 罗伯特·艾森里奇 申请人:鲍尔园艺公司