植物种子特异表达启动子OsSee1的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种水稻 种子特异表达启动子OsSeel及其应用，该启动子能够在水稻转基因调控体系中特异性的 驱动目标基因的在种子中的表达。
【背景技术】
[0002] 植物基因表达受生物体内各种理化因素的调节控制，植物能够根据自身需要及环 境的改变，定时、定位及定量地表达所需要的基因产物。基因表达在DNA水平、转录水平、转 录后水平、翻译水平、翻译后加工、运输及定位等各个层次都进行着精细的调控。基因转录 水平表达调控是基因表达调控中最主要的调控方式，在这一系列过程中涉及到启动子、终 止子、UTR序列等调控元件，在这些调控元件中，启动子决定转录起始点和转录频率，作用尤 为重要。
[0003] 启动子是RNA聚合酶能够识别并与之结合，从而起始基因转录的一段DNA序列，通 常位于基因上游，其长度因生物种类而异。基因的启动子区基本上是由两部分组成：一部 分是形成普通性转录结构所需要的，通常称为核心启动区，包括转录起始点及邻近的TATA 框；另一部分是决定基因转录特异性和活性的区域。两部分都参与基因转录的调控，但后一 部分起主要的控制作用。核心启动子决定转录的准确起始，而启动子上游顺式调控元件则 决定时空差异表达的有序进行。经序列分析研究发现，组织特异启动子的顺式调控元件有 一定的保守性，而这些特异序列元件也正是基因特异表达所必须的。
[0004] 种子特异性启动子具有基本启动子、起始子和上游元件。其中，基本启动子和起始 子是行使转录所必要的。基因表达时间、表达部位需要启动子上的顺式调控元件与相应的 转录因子的协同作用。种子特异性启动子区别于其它类型启动子的显著特点是启动子上游 存在一些特异的调控元件，这些调控元件与调控种子特异性基因的特异表达有关。
[0005] 在组成型启动子的控制下，外源基因在转基因植物的所有部位和所有发育阶段表 达，不但造成植物能量和养分的消耗，可能导致宿主植物性状的改变，影响植物的生长发 育。而种子特异性启动子可以控制外源基因在植物种子中高效表达，避免外源基因在植物 的其它部位表达所造成的能量、营养浪费，减少对植物的不利影响。
[0006] 此外，我们的主要粮食作物和油料作物例如小麦、水稻、玉米和油菜等，其主要的 食用部位均为种子。因此，种子特异性启动子的研究对植物基因工程的发展和人们生产生 活水平的提高具有十分重要的意义。但是，很明显目前人们对种子特异启动子方面的研究 并不够，目前所公开的种子特异启动子并不能满足研究和生产的需要。
【发明内容】
[0007] 针对上述问题，本发明的目的是提供一种分离鉴定本底信号低、特异性高的新型 启动子，这种启动子对作物基因工程将有着重要的意义。
[0008] 为了实现上述目的，一方面，本发明提供一种水稻种子特异表达启动子OsSeel，该 水稻种子特异表达启动子OsSeel包含：
[0009] 1)序列表中SEQNo:1所不的DNA分子；或者
[0010] 2)在严格条件下与1)中的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；或者
[0011] 3)与1)或2)限定的DNA序列具有90%以上的同源性，且具有启动子功能的DNA 分子;或
[0012] 4)在SEQIDNO: 1中所示的核苷酸序列中添加、缺失或取代一个或多个核苷酸后 所获得的具有启动子功能的核苷酸序列。
[0013] 2)、3)和4)中水稻种子特异表达启动子序列与SEQIDNo: 1所示的DNA序列具有 相同的功能，即驱动目标基因在植物中表达。
[0014] 序列表中SEQIDNo: 1所示的DNA序列为来源于日本晴水稻（OryzasativaL cv.Nipponbare)的水稻种子特异表达启动子，本文中称为OsSeel或启动子OsSeel。具体 而言，本申请的发明人发现日本晴水稻（OryzasativaLcv.Nipponbare)基因上游包括转 录起始位点在内的1960bp的DNA序列，具有驱动目标基因水稻种子中特异性表达的功能， 并且分离克隆、并鉴定了该DNA序列的功能。
[0015] 另一方面，本发明提供一组扩增所述DNA片段或其部分片段的引物对。
[0016] 另一方面，本发明提供一种含有所述DNA片段的重组载体或表达盒。
[0017] 另一方面，本发明提供一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为在植 物表达载体PCAMBIA1391的多克隆位点插入所述的DNA片段得到的重组质粒，在所述重组 表达载体中，所述水稻种子特异表达启动子OsSee1连接于载体中待表达的基因序列的上 游
[0018] 优选地，所述待表达基因为具有改善水稻种子性状功能的基因。
[0019] 另一方面，本发明提供一种宿主菌或转化子，其特征在于，所述宿主菌或转化子包 含所述的水稻种子特异表达启动子OsSeel、所述的重组表达载体、或所述的表达盒。
[0020] 另一方面，本发明提供一种所述水稻种子特异表达启动子OsSeel在培育转基因 植物中的应用，其特征在于，所述应用包括：将所述的水稻种子特异表达启动子OsSeel连 接于载体中待表达的基因序列上游，从而构建重组表达载体；将所述重组表达载体转化到 水稻细胞、组织或器官中进行培育，优选地，所述待表达基因为具有改善水稻种子性状功能 的基因。
[0021] 在一种实现方式中，在所述重组表达载体中，所述水稻种子特异表达启动子 OsSeel连接于待表达的基因序列的上游；所述待表达的基因为Gus基因，所述重组表达载 体为pCAMBIA1391-〇sSeel，该重组表达载体为将SEQIDNo:1所示的序列即OsSeel或启动 子OsSeel构建于pCAMBIA1391中得到的重组表达载体，本文中称为pCAMBIA1391-〇sSeel。
[0022] 另一方面，本发明提供一种所述水稻种子特异表达启动子OsSeel在培育高产水 稻中的应用，其特征在于，所述应用包括：将所述的水稻种子特异表达启动子OsSeel与目 标基因相连，并构建于载体中获得重组表达载体，然后，将所述重组表达载体转化到水稻细 胞、组织或器官中进行培育。
[0023] 本发明中所提供的启动子的DNA序列为（与序列表中SEQIDNo: 1中相同）：
[0024] AATCACTACGCAATATGTTTGTAGCCCAATTTCAAGACTTACCGATCATTTGTGCA GGAGGGTGTGAAACATGGGATCTCTTGCTTGTCTCAAGACTCGTATGGTGCCTATATTGCTGCGTCATGCATGGATA ACAGGTATAACCGCAATCAACCACACTGCCTCAGACTTAATATGCCATTTGTGAAGGCTGCCTTTGACTTTATAAGC CTTTCAGGATCTATTTGTACAGTGCTCTTCATATGGATAAAGGCCCAATTAAGGCTTACACTGGCAGCAAAATTGAA TCTTTTTTTGTCAAGGTCAGTGAGTGAACAAGCTGAGTTGATTTCCATTTTTCAAACCGCATGCCTGCTTGTTCTTA GGTAGTTTTATCTGCTATGTTTTATAACACCTGATATGTTGGTCAAATGCAGTCTGCTATCAGCCCTGATGGAACTC ACATTCTTGGTGGTTCGAGTGATGGCAACGTGTACTTATGGCAGGTAGTTGTTGGATCATGTTATCATTTCGCACAC GCATTAGCTGCTCTTTTACTTTCTATTCATGCCACTACTTTTTCACTGACATAGGTGGATCAGCCTGAAAGAGGTCC TATAATTTTGGAAGGCCATGAAGGTGAAGCTACTTCAGTTGACTGGTATGTTCTACATACAATTGTAGTTTTTTTTT GTGTAAATCTTATCAACCATCCAATGTTCAGATTTCAGTACGATTTTTTCACAATTTTCAGGTGTGCATCAGAGGTC GGGAAGATCGCAACGTCATCTGACGATTCCAAGGTGAGTATGTGATTAACCTTGCAAATTTTGTTCATTCAACTTTC ATGAATCTTATGAGAATGAGATCCTTTTCTTTTTCTATTACACACCTACATGTTGCAAGCGAATTTAAATGCCTGTT TTGGTATGTAGAAAGGGGAGCTGCTGATATTCAGTATTTTTTTTAAGAAAACCACTGATAACAACACTTTATGATGT GTATCTATCAGGTTCGCGTATGGAATACTGAGAGAAGGGTGTTCCCAAACACAAGTTCCCCAACGGTCATCCGCAAG AGAATAACCGCACCAAACACTGGAAGCCGGTCTGCTAGCCATGAGCTAGCTACTACCTCAAGAGATGTAGGAGTAGC AGCCTGCACCAGTGCAGATGGTGAATTGCCAACTGGTTCACGCTCTCCCCTTCAGCCCAGAGTACTGGAGTTTGGCA CACCGGAGTCAGCGAAGAAGAGAGCCTTTAGGTTGTTTCAGGAGGACTCATTGGACATAAGGAAAAGCCCAGAGGCT CAAATGAACAGCCCTTCTTCGGTTCTAAGCCCCCCACATTCACTGAAGAGGAGAACAATTCGGGACTACTTTGCTAG TAGCTCATCTTGTGAGCACACCAAGCATGTCCATGACCTTGCACTCTTGGCTCACTCGTCAACTGTGAAGAACCTCA AAAATGCTCAATATAGCTACAGGTGCCTGAAAAAATAACTTTAAAGTTTTGAACATCGATTTCACTAAACAACAATT ATTATCTCCCTCTGAAATGTTGCTACCTAAGATGATAGTTTAGAACTCTAGAATCATTGTCGGCGGAGAAAGTAAAT TATTTTCCCCAAATTTCCAGCTATGAAAAAACCCTCACCAAACACCATCAAACAAGAGTTCACCAAACCGCCCATGC GGCCATGCTGTCACGCAACGCACCGCATTGCCTGATGGCCGCTCGATGCATGCATGCTTCCCCGTGCACATATCCGA CAGACGCGCCGTGTCAGCGAGCTCCTCGACCGACCTGTGTAGCCCATGCAAGCATCCACCCCCTCCACGTACACCCC CTCCTCCTCCCTACGTGTCACCGCTCTCTCCACCTATATATGCCCACCTGGCCCCTCTCCTCCCATCTCCACTTCAC CCGATCGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCGTTGCATTCATCTTGCMGCTAGCTTAGCA
[0025] 需要说明的是：上述启动子的DNA序列中，序列开头以斜体并加粗表示的序列 "AATCACTACGCAATATGTTTGT"为获得启动子过程中使用的正向引物的留存序列，共计22bp; 序列末尾以斜体并加粗表示的序列"CATCTTGCTAGCTAGCTTAGCA"为获得启动子过程中使用 的反向引物的留存序列（该留存序列与反向引物的相应序列互补），共计22bp;该DNA序列 中剩余的部分则为获自日本晴水稻中的DNA序列。需要强调的是，本文中所提到的启动子 既可以指上述整个DNA序列，也可以指去除上述引物留存序列后的DNA序列。需要说明的 是，即便本领域技术人员在本发明的基础上，采用其他引物获得了类似序列，其也落入本发 明的保护范围之内。
[0026] 综上所述，本发明的发明人发现、提取并鉴定了日本晴水稻（OryzasativaL cv.Nipponbare)OsSeel基因上游包括转录起始位点在内的1960