一种抑制Survivin基因表达的siRNA及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明公开了一种抑制survivin基因表达的siRNA分子及其在制备抗肿瘤药物 的应用，属于生物医药技术领域。
【背景技术】
[0002] 目前，恶性肿瘤临床进展快、生存期短以及传统临床治疗的中远期疗效均不理想， 化疗药物一方面起到治疗作用，同时另一方面，化疗药物的毒副作用对患者的身体起到破 坏作用。因此，因而寻找新的肿瘤治疗策略是全球临床及科研工作者所面临的重大问题。随 着分子生物学的发展，针对肿瘤基因进行靶向治疗成为癌症治疗研究的方向。药物作用于 肿瘤某分子、某基因等靶向部位，一方面提高了疗效，另一方面减少了药物的用量。寻找能 成为肿瘤治疗的标靶已成为治疗肿瘤的前提之一。可能成为药物作用的标靶包括：癌细胞 具有的特殊的抗原、特殊生长因子受体、肿瘤血管生长相关因子、癌细胞特殊信息传递途径 中的各种分子、癌细胞内细胞周期和细胞凋亡的调控分子。
[0003] 人类survivin基因是1997年美国耶鲁大学的Ambrosini等利用效应细胞蛋白酶 受体-1(effectorcellproteasereceptor_l，EPR-l)cDNA在人类基因组的杂交筛选中分 离并克隆出来的，与EPR-1同位于染色体17q25,全长14. 7kb，由3个内含子和4个外显子组 成，其mRNA长约1.9kb，其编码产生的蛋白由142个氨基酸组成，相对分子量为16. 5X103， 是近年来发现的凋亡抑制蛋白（inhibitorofapoptosisprotein，IAP)家族中的一个新 成员，具有抑制细胞凋亡和维持细胞有丝分裂的双重功能，在正常的终末分化组织中几乎 不表达。在生理状态下，survivin仅表达于成人分泌期子宫内膜、胎盘、睾丸、胸腺及胚胎 中，但在病理状态下，survivin广泛表达于人类各种恶性肿瘤组织中，如胃癌、食管癌、结 直肠癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌、肺癌、白血病、黑色素瘤、淋巴瘤、III~IV期神经母细胞瘤等。 survivin表达增高可抑制肿瘤细胞凋亡而促进其增殖，而且其表达与病程进展明显相关。 因此，survivin可能作为一种新的肿瘤标志物，成为检测恶性肿瘤的指标。
[0004] RNA干扰survivin表达技术，RNA干扰（RNAinterference，RNAi)是指在生物体 细胞内，外源性或内源性的双链RNA(double-strandedRNA)引起与其同源的mRNA特异性 的降解，从而抑制survivin基因的转录和表达，具有高度特异性、高效性的特点。总结近年 来的研究成果，其在临床应用中具有较广阔的前景。
【发明内容】
[0005] 本发明公开一种抑制survivin基因表达的双链siRNA分子其在抗肿瘤药物的应 用，是一种新的siRNA序列，可以抑制肿瘤细胞的增殖和转移。
[0006] 本发明所述的双链SiRNA分子，其特征在于，该双链SiRNA分子是一种高效靶向 survivin基因的广谱双链的小分子干扰RNA (siRNA)，具有如下序列结构：
[0007] 正义链 5 ' -GAGACAGAAUAGAGUGAUA-3 'SEQIDN0:1
[0008] 反义链 5 ' -UAUCACUCUAUUCU⑶CUC-3 'SEQIDN0:2
[0009] 本发明所述的双链siRNA分子的主干序列即为SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示 的核苷酸序列，即正义链和反义链分别具有SEQIDN0:1和2所示的核苷酸序列的双链分 子。
[0010] 优选的，所述双链SiRNA分子，具有如下的序列结构：
[0011]正义链：5 '-GAGACAGAAUAGAGUGAUAtt-3 'SEQIDN0:3
[0012] 反义链：5 ' -UAUCACUCUAUUCU⑶CUCtt-3 'SEQIDN0:4。
[0013] 本发明的siRNA分子来源于针对survivin基因开放阅读框的功能保守区而制备 的siRNA分子库，该序列的正义链与survivin基因的mRNA结合，干扰survivin基因mRNA 的翻译，从而抑制肿瘤细胞的分裂，使肿瘤细胞阻滞在G2/M期。
[0014] 本发明的siRNA分子的优点在于，所制备的siRNA随机分布于survivin基因开放 阅读框区段，长度可控性分布于19-23bp，可以提高有效靶点的命中率。
[0015] 本发明还提出了一种siRNA重组质粒，所述的siRNA重组质粒包含前面所述的任 意一种双链siRNA分子的序列。由此，利用siRNA重组质粒转染动物细胞，能够有效的沉默 surivivin基因，进而诱导细胞凋亡、抑制肿瘤细胞分裂、抑制肿瘤血管的生成，从而能够有 效的治疗肿瘤。进一步，该siRNA分子与siRNA重组质粒能够有效的用于抗肿瘤药物的制 备，从而利用制备的抗肿瘤药物对患者进行给药，有效的治疗肿瘤。
[0016] 根据本发明还提出了一种survivin基因沉默试剂盒，所述试剂盒包含前面所述 的任意一种双链siRNA分子或siRNA重组质粒。利用本发明的试剂盒能够有效的将肿瘤患 者的细胞进行survivin基因沉默，从而能够有效的治疗肿瘤。
[0017] 本发明的siRNA分子可以作为抗肿瘤药物的有效成分，肿瘤疾病包括如白血病、 胃癌、前列腺癌、膀胱癌、宫颈癌，乳腺癌，肺癌，肝癌等。
[0018] 因而，本发明还提出了前面所述的任意一种双链siRNA分子、或者siRNA重组质粒 在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0019] 本发明提出一种抗肿瘤药物，该药物含有有效量的siRNA分子或siRNA重组质粒， 该抗肿瘤药物可以采用常规方法制备成相应制剂，如可被制成针剂形式，例如用生理盐水 或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。针剂、溶液等宜在无菌条件下 制造。
[0020] 本发明的积极效果在于：提供了一种新的高效革E1向survivin基因的广谱双链的 小分子干扰RNA(siRNA)，同时还公开了其在制备抗肿瘤药物中的应用。
【附图说明】
[0021] 图1是化学合成的siRNA转染两种细胞后实时定量PCR检测survivinmRNA表达 量柱形图，纵坐标表示survivin相对于GAPDH的mRNA表达水平；横坐标表示四个处理实验 组，分别为未转染的细胞组，转染实验包括三个siRNA浓度，分别为10nM、20nM和30nM。
[0022]图2是WesternBlot检测siRNA转染人前列腺癌细胞PC-3、肝癌细胞IfepG2、乳 腺癌细胞MCF-7和宫颈癌细胞Hela后的survivin蛋白表达量，NC所对应的是阴性对照组， EG所对应的是加入20nM/孔的siRNA组。
【具体实施方式】
[0023] 为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例 只用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
[0024] 实施例1 :siRNA沉默效率验证
[0025] 1.主要仪器、试剂和材料.
[0026] 1. 1仪器：核酸合成仪（GE公司）、PCR仪（ABI公司）；实时定量PCR(Bio-Rad);细 胞培养箱（Thermo)等。
[0027]1. 2 材料和试剂：RNAiMAX? (invitrogen)，DMEM培养基（Gibco)，
[0028]TurboCapturemRNAkit(QIAGEN)，SensiMix?one-StepKit(Quantace)等。其 他生化试剂均购于上海生工生物工程技术服务有限公司。
[0029] 1. 3PCR引物（百奥迈科生物技术有限公司合成）：
[0030]survivin正向引物：5 ' -AGAACTGGCCCTTCTTGGAGG-3 '
[0031]survivin反向引物：5 ' -CTTTTTATGTTCCTCTATGGGGTC-3 '
[0032]GA