抑制β2GPI表达的核酸的制作方法
【专利摘要】本发明提供了具有抑制β2GPI表达的活性的核酸、包含该核酸的医药组合物，以及提供了含有该核酸的、用于自身免疫病(例如APS、SLE等)以及血液透析中血栓的预防或治疗性药物。
【专利说明】
抑制β26ΡΙ表达的核酸
技术领域
[0001]本发明涉及用于抑制KGPI表达的核酸以及包含该核酸的医药组合物。
【背景技术】
[0002] β2-糖蛋白l(i32GPI)(又名为载脂蛋白H，ap〇H)是由326个氨基酸构成的糖蛋白，其 具有5个结构域相连而成的高级结构。02GPI被认为具有许多不同的生理作用，据报道，其涉 及血小板凝集反应、凝固和纤溶反应，以及巨噬细胞对氧化LDL的摄取(非专利文献1)。
[0003] 在与疾病相关的方面，已知02GPI是抗磷脂抗体综合征(APS)和系统性红斑狼疮 (SLE)这样的自身免疫性疾病中所出现的抗磷脂抗体的主要对应抗原。抗02GPI抗体与疾病 的病理形成也深度相关，通过使用动物模型的研究和临床研究已阐明，02GPI与抗02GPI抗 体形成的复合体在血管内皮细胞、单核细胞、血小板、滋养层细胞等多种细胞的膜受体上产 生活化信号，其继而可引起血栓和异常妊娠等APS的特征性病理(非专利文献2)。虽然预期 可通过特异性抑制KGPI和抗02GPI抗体形成的免疫复合物的形成，来预防或者治疗上述疾 病，然而，由于02GPI在血液中以50~500μg/ml的相对高浓度存在，难以使用例如常规抗体 药物实现对全部KGPI的持续抑制(非专利文献3)。
[0004] 在另一方面，作为抑制基因自身表达的方法，利用例如RNA干扰(下文称为RNAi)等 方法是已知的。具体而言，发现通过引入具有与靶序列相同的序列的双链RNA，特异性地抑 制了靶基因的表达，所述RNA被命名为短干扰RNA(siRNA)(专利文献1)。此外，作为除RNA干 扰之外的抑制基因表达的方法，反义方法也是已知的（专利文献2)。
[0005] 尽管靶向人02GPI基因的siRNA序列的一部分已经被公开，抑制人02GPI基因表达 的siRNA序列仍是未知的(专利文献3、4)。
[0006] 现有技术文献
[0007] 专利文献
[0008] 专利文献 1:W0 2001/75164
[0009] 专利文献2:W0 98/56905
[0010] 专利文献3:W0 2005/116204
[0011] 专利文献4:W0 2008/043561
[0012] 非专利文献
[0013] 非专利文献 1:Αηη·Ν·Y.Acad.Sci.，1285,44-58(2013)
[0014] 非专利文献2:N.Engl.J.Med.，368，1033-1044(2013)
[0015] 非专利文献3:J.Thromb.Haemost.，9，1275-1284(2011)
【发明内容】
[0016] 发明所要解决的课题
[0017] 本发明的目的在于提供一种抑制I32GPI表达的核酸。本发明的目的还在于提供一 种用于预防或治疗KGPI表达相关疾病的医药组合物。
[0018] 解决课题的手段
[0019] 本发明涉及以下的（1)~（13)。
[0020] (1) 一种双链核酸，其降低I32GPI基因的表达，所述双链核酸由有义链和反义链组 成，所述双链核酸包含至少11个碱基对的双链区，其中在上述反义链中的链长为至少17个 核苷酸且至多30个核苷酸的寡核苷酸链与选自表1 -1至表1 -16中所述的组中的靶标f32GP I mRNA序列互补。
[0021 ] (2)如上述（1)中所述的双链核酸，其中所述双链区为11~27个碱基对，与选自表 1-1至表1-16中所述的组中的靶标02GPI mRNA序列互补的所述反义链中，从5'端起算的第2 个核苷酸与该靶标KGPI mRNA序列的从3 '端起算的第2个脱氧核糖核苷酸互补。
[0022] (3)如上述（1)中所述的双链核酸，其中所述有义链的3'端和所述反义链的5'端形 成平末端。
[0023] (4)如上述（1)中所述的双链核酸，其中所述有义链为21个核苷酸长，并且所述反 义链为21个核苷酸长。
[0024] (5)如上述(4)中所述的双链核酸，其降低02GPI基因的表达，其为含有19个碱基对 的双链区的经修饰双链核酸，所述双链区中的核苷酸中的40~65 %包含2 ' -0-甲基修饰核 苷酸。
[0025] (6)如上述（1)中所述的双链核酸，其中所述反义链包含选自表1-1至1-16和表3-1 至3-5的"反义链"所记载的组。
[0026] (7)如上述（1)中所述的双链核酸，其中所述有义链包含选自表1-1至1-16和表3-1 至3-5的"有义链"所记载的组。
[0027] (8)如上述（1)中所述的双链核酸，其包含选自表1-1至1-16和表3-1至3-5所记载 的有义链/反义链所组成的组的1对有义链/反义链的序列。
[0028] (9)如上述(1)~(8)中任一项所述的双链核酸，其包含配体。
[0029] (10)-种单链核酸，其仅由如上述(1)~(9)中任一项所述的双链核酸中的反义链 组成。
[0030] (11)医药组合物，其包含如上述(1)~（10)中任一项所述的核酸。
[0031] (12)-种治疗抗02GPI抗体所介导疾病的方法，其包括下述步骤：向有此治疗需要 的人施用治疗有效量的如上述(1)~（10)中任一项所述的核酸或者如上述(11)中所述的医 药组合物。
[0032] (13)如上述(12)所述的方法，其中，所述疾病是自身免疫病或者血栓。
[0033]发明的效果
[0034]通过施用本发明的核酸或者包含该核酸的医药组合物，可抑制02GPI的表达。特别 地，可用于治疗或预防与KGPI表达相关的疾病。
【具体实施方式】
[0035]作为本发明的核酸靶向的β2GPI基因（编码β2GPI的基因），可举出对应于以 Genbank登录号NM_000042登录的β2GPIcDNA(SEQIDN0:3541)的产生全长β2GPImRNA的 基因。
[0036] 1.本发明的核酸
[0037] 在本发明中，包含与02GPI mRNA互补的核苷酸序列的核酸被称为反义链核酸，包 含与反义链核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列的核酸也被称为有义链核酸。在本说明书 中，除非另有指明，"本发明的核酸"以涵盖反义链核酸和有义链核酸，以及有义链和反义链 核酸配对的双链核酸的含义使用。
[0038] 作为本发明的核酸，可以是由核苷酸或者具有与核苷酸同等功能的分子聚合而成 的任意的分子，可举出例如，作为核糖核苷酸的聚合物的RNA，作为脱氧核糖核苷酸之聚合 物的DNA，由RNA和DNA构成的嵌合核酸，以及这些核酸的至少一个核苷酸被具有与核苷酸同 等功能的分子所替换的核苷酸聚合物。此外，这些核酸中含有至少一个与核苷酸同等功能 的分子的衍生物也被本发明的核酸所涵盖。尿嘧啶(U)能够毫无疑义地读为胸腺嘧啶(T)。
[0039] 与核苷酸具有同等功能的分子的实例包括例如核苷酸衍生物等。作为核苷酸衍生 物，可以是通过对核苷酸施以修饰而获得的任意的分子，例如，较之RNA或DNA，为改进核酸 酶抗性或者使其稳定，增强对互补链核酸的亲和力，增强细胞通透性，或者使之可视化，通 过对核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸等施以修饰而获得的分子是优选使用的。
[0040] 作为通过对核苷酸施以修饰而获得的分子，可举出例如糖部分经修饰的核苷酸、 磷酸二酯键经修饰的核苷酸、碱基经修饰的核苷酸、其中糖部分、磷酸二酯键和碱基中至少 之一经修饰的核苷酸等。
[0041] 作为糖部分经修饰的核苷酸，可以是针对核苷酸中糖的化学结构的部分或全部以 任意取代基进行了修饰或者取代而成的核苷酸，或者是以任意原子进行了取代而成的核 酸，但是2 修饰核苷酸是优选使用的。
[0042] 作为2 ' -修饰核苷酸，可举出例如：核糖的2 ' -OH基被选自Η、OR、R、R ' OR、SH、SR、 NH2、NHR、NR2、N3、CN、F、Cl，Br和I(R是烷基或芳基，优选碳原子数为l~6的烷基，R'是亚烷 基，优选碳原子为1~6的亚烷基)的取代基取代的核苷酸，优选为2 ' -OH基被H、F或甲氧基取 代的核苷酸，更优选2 ' -OH基被F或甲氧基取代的核苷酸。此外，还可举出2 ' -OH基被选自2-(甲氧基）乙氧基、3-氨基丙氧基、2-[(N，N-二甲基氨基)氧基]乙氧基、3-(N，N-二甲基氨基） 丙氧基、2-[2-(N，N-二甲基氨基）乙氧基]乙氧基、2-(甲基氨基)-2-氧基乙氧基、2-(N-甲基 氨基甲酰基）乙氧基和2-氰基乙氧基等取代基取代而成的核苷酸。
[0043]对于双链核酸区内的核苷酸而言，2 ' -0-甲基修饰的核苷酸优选以10~70 %被含 有，更优选以20~40%被含有，特别优选以40~65%被含有。此外，对于有义链中的核苷酸 而言，2 ' -0-甲基修饰的核苷酸优选以20~40 %被含有，更优选以40~60 %被含有，特别优 选以60~100 %被含有。此外，对于反义链中的核苷酸而言，2 ' -0-甲基修饰的核苷酸优选以 0~40 %被含有，更优选以10~20 %被含有，特别优选以20~40 %被含有。
[0044] 作为糖部分经修饰的核苷酸，可举出通过向糖部分引入交联结构而得到的具有两 个环状结构的交联结构型人工核酸(Bridged Nucleic Acid，BNA)，具体可举出：其中2'位 氧原子和4'位碳原子通过亚甲基交联的锁人工核酸(Locked Nucleic Acid，LNA)、亚甲基 交联结构型人工核酸（Ethylene bridged nucleic acid，ENA) [Nucleic Acid Research， 32，el75(2004)]等，以及肽核酸（PNA)[Acc.Chem.Res.，32,624(1999)]、氧-肽核酸（OPNA) [J.Am.Chem.Soc.，123,4653(2001)]、肽核糖核酸（PRNA)[ J.Am.Chem.Soc.，122,6900 (2000)]等。
[0045] 作为磷酸二酯键经修饰的核苷酸，可以是针对磷酸二酯键的化学结构的部分或者 全部以任意取代基进行了修饰或取代而成的核苷酸、或者以任意原子进行取代而成的核苷 酸，例如，磷酸二酯键被硫代磷酸酯键取代的核苷酸，磷酸二酯键被烷基磷酸酯键取代的核 苷酸，磷酸二酯键被亚磷酰胺键取代的核苷酸，等。
[0046] 作为碱基修饰的核苷酸，可以是针对核苷酸的碱基的化学结构的部分或者全部以 任意取代基进行了修饰或取代而成的核苷酸、或者以任意原子进行了取代而成的核苷酸， 例如，碱基中的氧原子被硫原子取代而成的核苷酸，氢原子被碳原子数为1~6的烷基、卤素 等取代而成的核苷酸，甲基被氢、羟甲基、碳原子数为2~6的烷基取代而成的核苷酸，氨基 被碳原子数为1~6的烷基、碳原子数为1~6的烷酰基、氧基、羟基等取代而成的核苷酸。
[0047] 作为核苷酸衍生物，可举出在核苷酸或糖部分、磷酸二酯键和碱基至少之一被修 饰的核苷酸衍生物上直接或者介由接头附加了肽、蛋白质、糖、脂质、磷脂、酚嗪、叶酸、菲 啶、蒽醌、吖啶、荧光素、罗丹明、香豆素、染料等其他化学物质而成的物质，具体可举出，附 加有5 聚胺的核苷酸衍生物，附加有胆固醇的核苷酸衍生物，附加有类固醇的核苷酸衍生 物，附加有胆酸的核苷酸衍生物，附加有维生素的核苷酸衍生物，附加有Cy5的核苷酸衍生 物，附加有Cy3的核苷酸衍生物，附加有6-FAM的核苷酸衍生物，以及附加有生物素的核苷酸 衍生物等。
[0048]核苷酸衍生物可以与核酸中的其他核苷酸或核苷酸衍生物形成交联结构，例如亚 烷基结构、肽结构、核苷酸结构、酯结构、及这些结构中的至少一种组合而成的结构等等。
[0049] 本发明的核酸还涵盖核酸分子中的部分或全部原子被不同质量数的原子（同位 素)取代而成的核酸。
[0050] 在本说明书中，"互补"意为两个碱基能够形成碱基配对的关系，表示例如腺嘌呤 和胸腺嘧啶或尿嘧啶之间的关系、鸟嘌呤和胞嘧啶之间的关系这样的介由疏松的氢键在整 个双链区采取双螺旋结构的形式。
[0051 ]在本说明书中，"互补的"不仅意为两个核苷酸序列之间完全互补，还包括核苷酸 序列之间有0~30%、0~20%或0~10%的错配碱基，例如与02GPI mRNA互补的反义链表示 可在与mRNA部分核苷酸序列完全互补的核苷酸序列中含有一个或更多个碱基取代，具体 地，反义链可含有相对于靶标基因的靶序列而言1~8个(优选1~6个、1~4个、1~3个，特别 是2个或1个)错配的碱基。例如，当反义链为21个碱基长时，其相对于靶标基因的靶序列而 言可含有6、5、4、3、2或1个错配，该错配的位置可以是序列的5'端或3'端。
[0052]此外，"互补的"涵盖了一条核苷酸序列与其他核苷酸序列完全互补而且添加/或 缺失了一个或更多个碱基的核苷酸序列的情况。KGPI mRNA与本发明的反义链核酸可由于 在反义链中添加和/或缺失碱基，而在反义链和/或靶标02GPI mRNA区域含有1或2个凸出碱 基。
[0053]本发明的核酸为包含与02GPI mRNA的一部分核苷酸序列互补的核苷酸序列的核 酸和/或包含与所述核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列的核酸即可，其可由任意的核苷 酸或其衍生物构成。对本发明的双链核酸而言，只要包含与靶标02GPI mRNA序列互补的核 苷酸序列的核酸与包含和该核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列的核酸能够形成双链，就 可以是任意长度，能够形成双链的序列长度一般是11~35个碱基，优选15~30个碱基，更优 选17~25个碱基，进一步优选17~23个碱基，特别优选19~23个碱基。
[0054]作为本发明的反义链核酸，可以使用包含与靶标02GPI mRNA序列互补的核苷酸序 列的核酸，也可使用该核酸中的1~3个碱基(优选1~2个碱基，更优选1个碱基)缺失、替换 或者添加而成的核酸。
[0055] 作为本发明的抑制02GPI表达的核酸，优选使用:包含与靶标02GPI mRNA序列互补 的核苷酸序列且能够抑制02GPI表达的单链核酸，或者包含与靶标02GPI mRNA序列互补的 核苷酸序列的核酸与包含和该核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列的核酸所构成的且能 够抑制i32GP I表达的双链核酸。
[0056] 在本发明中，双链核酸表示其中两条核苷酸链配对、具有双链区域的核酸。双链区 表示:构成双链核酸的核苷酸或其衍生物构成碱基配对从而形成双链的部分。双链区通常 为11~27个碱基对，优选15~25个碱基对，更优选15~23个碱基对，进一步优选17~21个碱 基对，特别优选17~19个碱基对。
[0057] 构成双链核酸的单链核酸通常为11~30个碱基，优选15~29个碱基，更优选15~ 27个碱基，进一步优选15~25个碱基，特别优选17~23个碱基，最优选19~21个碱基。
[0058] 当本发明的双链核酸在紧连着双链区的3'侧或者5'侧具有不形成双链的额外核 苷酸或核苷酸衍生物时，这称为突出部(overhang)。当存在突出部时，构成突出部的核苷酸 可以是核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或者其衍生物。
[0059] 作为具有突出部的双链核酸，可以使用在至少一条链的3'端或者5'端具有1~6个 碱基(通常为1~3个碱基)形成的突出部的双链核酸，优选使用具有2个碱基形成的突出部 的双链核酸，例如可举出具有dTdT或UU构成的突出部的双链核酸。突出部可存在于仅反义 链中、仅有义链中、或者存在于反义链和有义链两者中，在本发明中，优选使用在反义链和 有义链两者中均具有突出部的双链核酸。需要说明的是，反义链包含双链区以及随后的突 出部，该反义链在由至少17个核苷酸且至多30个核苷酸组成的寡核苷酸链中与选自表1-1 至表1-16中所记载的组中的靶标02GPI mRNA序列完全互补。此外，作为本发明的双链核酸， 也可使用例如Dicer等核酸酶作用于上述双链核酸生产的核酸分子(W02005/089287)、不含 有3 '端或5 '端的突出部的形成平末端的双链核酸、仅有义链突出的双链核酸（US2012/ 0040459)等。
[0060] 作为本发明的双链核酸，可使用：由与靶标基因的核苷酸序列或其互补链的核苷 酸序列相同的序列组成的核酸，也可使用该核酸的至少一条链的5'端或3'端缺失1~4个碱 基所得的核酸与含有和该核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列的核酸形成的双链核酸。 [0061 ] 本发明的双链核酸可以是RNA彼此形成双链的双链RNA(dsRNA)、DNA彼此形成双链 的双链DNA(dsDNA)，或者RNA与DNA形成双链的杂合核酸。或者，双链中的一条链或者两条链 可以是DNA和RNA的嵌合核酸。优选双链RNA(dsRNA)。
[0062]优选地，本发明的反义链的从5'端起算的第2个核苷酸与靶标02GPI mRNA序列的 3'端起算的第2个脱氧核糖核苷酸互补，更优选地，反义链的5'端起算的第2~7个核苷酸与 靶标02GPI mRNA序列的3'端起算的第2~7个脱氧核糖核苷酸完全互补，进一步优选地，反 义链的5'端起算的第2~11个核苷酸与靶标02GPI mRNA序列的3'端起算的第2~11个脱氧 核糖核苷酸完全互补。此外，优选地，本发明的反义链的从5'端起算的第11个核苷酸与靶标 02GPI mRNA序列的3'端起算的第11个脱氧核糖核苷酸互补，更优选地，反义链的5'端起算 的第9~13个核苷酸与靶标02GPI mRNA序列的3'端起算的第9~13个脱氧核糖核苷酸完全 互补，进一步优选地，反义链的5 '端起算的第7~15个核苷酸与靶标02GPI mRNA序列的3 '端 起算的第7~15个脱氧核糖核苷酸完全互补。
[0063] 作为产生本发明核酸的方法，没有特别限制，可举出已知的使用化学合成的方法 或者酶转录的方法等。作为已知的使用化学合成的方法，可以是亚磷酰胺法、硫代磷酸酯 法、磷酸三酯法、CEM法[Nucleic Acid Research，35,3287(2007)]等，例如，可通过ABI3900 高通量核酸合成仪来合成。合成结束之后，进行从固相脱离，保护基解保护以及目标产物纯 化等。期望通过纯化而获得纯度90 %以上、优选95%以上的核酸。在双链核酸的情况下，可 将合成和纯化得到的有义链和反义链以合适的比例（例如相对于1当量的反义链而言，0.1 ~1 〇当量，优选〇. 5~2当量，更优选0.9~1.1当量，进一步优选等摩尔量的有义链)混合之 后进行退火再使用，或者可省去退火步骤直接使用。退火可以在能够形成双链核酸的任意 条件下进行，通常如下所述进行:将有义链、反义链等摩尔量混合，94°C加热约5分钟，然后 缓慢冷却至室温。作为制备本发明核酸的酶转录法，可使用以下方法:使用具有目标核苷酸 序列的质粒或DNA作为模板，使用噬菌体RNA聚合酶例如T7、T3或SP6RNA聚合酶进行转录。
[0064] 本发明的核酸可通过转染用载体(优选阳离子型脂质体等阳离子型载体)被引入 到细胞内。此外，也可通过磷酸钙法、电穿孔法、直接细胞内注射法来引入。
[0065] 本发明的核酸中5'端、3'端和/或序列内部可以被1个或更多个配体和荧光团所修 饰，配体或荧光团修饰的核酸也称为核酸缀合物。在固相上进行延长反应时，可通过用能够 在固相上反应的修饰剂进行反应，从而在5'端、3'端和/或序列内部施以修饰。此外，也可预 先合成并纯化引入了氨基、巯基、叠氮基或者三键等官能团的核酸，通过修饰剂与它们发生 作用从而得到核酸缀合物。作为配体，可以是与生物分子有亲和力的分子，可举出例如胆固 醇、脂肪酸、生育酚、维甲酸等脂类，Ν-乙酰基葡萄糖胺(GalNAc)、甘露糖(Man)等糖类，完整 抗体、Fab、VHH等抗体类，低密度脂蛋白（LDL)、血清白蛋白等蛋白类，RGD、NGR、R9、CPP等肽 类，叶酸等小分子，合成聚氨基酸等合成聚合物，核酸适配体等，它们也可组合使用。作为荧 光团，可举出Cy3系列、Alexa系列、黑洞淬灭剂等。
[0066] 可使用在引入到细胞后能够表达本发明核酸的载体，来代替本发明的核酸。具体 地，可将编码本发明核酸的序列插入到表达载体中启动子的下游从而构建表达载体，然后 将表达载体引入到细胞中，由此表达该核酸。作为表达载体，可以是pCDNA6.2-GW/miR (Invitrogen公司制）、pSilencer 4. l_CMV(Ambion公司制）、pSINsi_hHl DNA(宝生物公司 制）、pSINsi_hU6DNA(宝生物公司制）、pENTR/U6(Invitrogen公司制）等。
[0067] 此外，可将本发明的核酸编码序列插入到病毒载体的启动子下游，将该载体引入 包装细胞，用以生产重组病毒载体。作为病毒载体，可以是逆转录载体、慢病毒载体、腺病毒 载体、腺相关病毒载体等。
[0068] 2.具有抑制02GPI表达活性的核酸
[0069] 可基于例如以Genbank Accession Ν〇·ΝΜ_000042登录的人02GPI全长mRNA的cDNA (有义链)核苷酸序列（SEQ ID N0:3541)来设计本发明的反义链和有义链。
[0070] 作为具有抑制I32GPI表达活性的核酸，可以是下述具有抑制02GPI表达活性的双链 核酸，其由含有与KGPI mRNA互补的核苷酸序列的本发明反义链核酸以及含有与上述核酸 的核苷酸序列互补的核苷酸序列的本发明有义链核酸组成。构成所述双链核酸的单链核酸 通常是11~30个碱基，优选15~29个碱基，更优选15~27个碱基，进一步优选15~25个碱 基，特别优选17~23个碱基，最优选19~21个碱基。所述双链核酸具有通常15~27个碱基 对、优选15~25个碱基对、更优选15~23个碱基对、进一步优选15~21个碱基对、特别优选 15~19个碱基对的双链区。
[0071]可通过将所述双链核酸导入细胞，来抑制I32GPI的表达。例如，将数PM-数nM浓度的 本发明双链核酸导入细胞，之后可在24小时以上例如48小时的培养阶段中抑制02GPI mRNA 的表达。
[0072]此外，对本发明的双链核酸的02GPI mRNA表达抑制活性的评价可通过以下方式进 行:使用阳离子脂质体等将该核酸等转染到人细胞系等，培养一段时间后，对该人细胞系中 02GPI mRNA的表达水平进行定量。
[0073]作为具有02GPI表达抑制活性的核酸，除了上述双链核酸之外，也可以是含有与β 2GPI mRNA的部分核苷酸序列互补的核苷酸序列的核酸，并且其是抑制02GPI表达的单链核 酸。构成该核酸的单链核酸通常是8~30个碱基，优选12~30个碱基，更优选12~20个碱基。 [0074] 通过将这些单链核酸导入细胞，也可抑制I32GPI表达。例如，将数pM-数nM浓度的本 发明单链核酸导入细胞，之后可在24小时以上例如48小时的培养阶段中抑制02GPI mRNA的 表达。
[0075]此外，对本发明的单链核酸的02GPI mRNA表达抑制活性的评价可通过以下方式进 行:使用阳离子脂质体等将该核酸等转染到人细胞系等，培养一段时间后，对该人细胞系中 02GPI mRNA的表达水平进行定量。
[0076] 3.本发明的医药组合物
[0077] 本发明还涉及含有上述双链核酸、单链核酸等核酸作为有效成分的医药组合物。 本发明的医药组合物可用作APS、SLE等自身免疫病和血液透析中血栓的治疗剂或预防剂。
[0078] 该医药组合物可包含能有效地将核酸转移到细胞内的运载体。作为将核酸有效转 移到细胞内的运载体，可以是，例如阳离子型运载体。作为阳离子型运载体，可以是阳离子 型脂质体或者阳离子型聚合物等。此外，作为能有效将核酸转移到细胞内的运载体，可以是 利用了病毒包膜的运载体。作为阳离子型聚合物，优选使用JetSKQbiogene公司）、Jet_PEI (聚乙稀亚胺，Qbiogene公司）等。作为利用了病毒包膜的运载体，优选使用GenomeOne(HVJ-E脂质体，石原产业公司）等。
[0079] 包含本发明核酸和上述运载体的组合物可通过本领域技术人员已知的方法制得。 例如，可通过将合适浓度的运载体分散液和核酸溶液混合来制备。当使用阳离子型运载体 时，由于核酸通常在水溶液中带负电荷，可通过常规方法在水溶液中混合从而容易地制备。 作为为了制备所述组合物使用的水性溶剂，可以是例如注射用水、注射用蒸馏水、生理盐水 的电解质溶液，例如葡萄糖溶液、甘露糖溶液的糖溶液，等等。此外，制备所述组合物时的pH 和温度等条件可由本领域技术人员适当选择。在必要时，还可通过超声分散装置、高压乳化 装置等进行分散处理，来形成均一组合物形式的所述组合物。因为包含运载体和核酸的组 合物制备的最合适方法及条件基于所用的运载体，本领域技术人员可选择对所用运载体来 说最合适的方法，而不限于上述方法。
[0080] 此外，作为本发明的医药组合物，还可优选使用例如核酸和引导颗粒作为组成部 分的复合颗粒构成的组合物，该复合颗粒覆盖了脂质膜。作为引导颗粒，可举出例如脂质组 装体、脂质体、乳液颗粒、聚合物、金属合金、微颗粒制剂等，优选可使用阳离子性脂质体。本 发明的引导颗粒可以以脂质组装体、脂质体、乳液颗粒、聚合物、金属合金、微颗粒制剂等中 两种以上组合得到的复合物作为组成成分，或者以脂质组装体、脂质体、乳液颗粒、聚合物、 金属合金、微颗粒制剂等与其他化合物(例如糖、脂质、无机化合物等)组合而成的复合物作 为组成成分。
[0081]作为覆盖所述复合颗粒的脂质膜，可以是，例如非阳离子型脂质、抑制颗粒聚集的 脂质以及作为组成成分的阳离子脂质。
[0082] 该组合物可通过例如W0 2006/080118公开等所记载的方法制备。
[0083]本发明的医药组合物中所含的核酸和运载体的混合比例合适地为相对于每1重量 份的核酸而言1~200重量份的运载体。优选为相对每1重量份的核酸而言2.5~100重量份 的运载体，更优选为相对每1重量份的核酸而言7~25重量份的运载体。
[0084] 关于本发明医药组合物的大小，优选地，平均粒径约10nm~300nm，更优选约30nm ~200nm，进一步优选约50nm~150nm。
[0085] 除了上述运载体之外，本发明的医药组合物还可包含医药可接受的载体 (carrier)、稀释剂等。医药可接受的载体、稀释剂等为基本上化学上无活性以及无害的组 合物，对本发明的医药组合物的生物活性完全没有影响。这些载体和稀释剂的例子包括盐 溶液、糖溶液、甘油溶液、乙醇等，但不限定于此。
[0086] 本发明的医药组合物含有治疗或预防疾病有效量的所述复合物，并且以适于施用 给患者的形式提供。本发明的医药组合物的制剂形态可以是，例如注射剂、滴眼剂、吸入剂 等液体制剂，例如软膏剂、洗剂等外用制剂。
[0087] 对于液体制剂来说，本发明医药组合物中有效成分的浓度范围通常为0.0 01~ 25%(w/v)，优选0.1~10% (w/v)，更优选0.5~5%&八）。本发明医药组合物还可含有合适 量的医药可接受的任何添加剂，例如乳化辅助剂、稳定剂、等渗剂、pH调节剂等。医药可接受 的任何添加剂可在所述复合物分散之前或者分散之后在适当的步骤中加入。
[0088] 所述液体制剂的pH通常被调整到约5.0~约8.5，优选约6.0~约8.0，优选地，使用 膜滤器等过滤除菌等进行灭菌处理。
[0089] 本发明的医药组合物还可以制备成冷冻干燥制剂的形式。冷冻干燥制剂可通过在 对核酸和运载体进行分散处理后冷冻干燥处理来制备。冷冻干燥处理可通过常见方法进 行。例如，可以通过将上述分散处理后的复合物溶液在无菌状态下以给定量分装到小瓶中， 在约-40~-20°C的条件下预干燥约2小时，在约0~10°C减压条件下进行第一干燥，然后在 约15~25°C减压条件下进行第二干燥，来进行冷冻干燥。然后，可通过例如用氮气替换小瓶 内部气体，加盖，从而得到本发明的医药组合物的冷冻干燥制剂。
[0090] 冷冻干燥制剂可通过添加任何合适溶液使其再溶解来使用。此类溶液可以是注射 用水、生理盐水等电解质溶液，葡萄糖溶液，其他常见输注液等。此类溶液的液体量，根据用 途不同各异，没有特别的限制，优选为冷冻干燥前液体量的〇. 5至2倍量，不超过500ml。
[0091] 对于包括人在内的动物而言，本发明的医药组合物可通过例如静脉内施用、动脉 内施用、经口施用、组织内施用、经皮施用、经粘膜施用或者经直肠施用来施用，优选根据患 者的症状以合适方法施用。特别地，优选使用静脉施用、经皮施用、经粘膜施用。此外，也可 使用癌症部位施用等局部施用。对于用于这些施用方法的合适剂型，可举出各种注射剂、经 口剂、滴注剂、吸收剂、滴眼剂、软膏剂、洗剂、栓剂等。
[0092 ]优选地，考虑到药物、剂型、年龄、体重等患者状态、施用途径、疾病性质和程度等， 来确定本发明医药组合物的用量，其通常为：以核酸的质量计，对成人每天而言，O.lmg~ l〇g/天，优选lmg~500mg/天。根据情况，低于这些用量的剂量可能是足够的，或者相反，也 可能需要高于这些用量的剂量。可以每天一次至数次施用，也可以间隔一天至数天施用。
[0093] 以下，通过实施例来解释本发明。但是，本发明并不限于这些实施例。
[0094] 实施例
[0095] 实施例1双链核酸的制备
[0096] 委托Sigma Aldrich公司合成了SEQ ID NO: 1~1180所示的核糖核苷酸构成的有 义链，SEQ ID N0:1181~2360所示的核糖核苷酸构成的反义链，以及它们退火获得的双链 核酸（SEQ ID Ν0:η(η = 1~1180)所示的有义链和SEQ ID N0:[n+1180]所示的反义链配 对)。
[0097] 实施例2I32GPI mRNA敲减活性的测定
[0098]在96孔培养板中以5000个细胞/80微升/孔接种人肝癌来源细胞系HepG2细胞(获 得自ATCC，ATCC号：HB-8065)。将含有10%胎牛血清（？83)的]\^]\1培养基（由1^。 Technologies公司制造，产品目录编号No. 11095-098)用作培养基。表1所记载的双链核酸 和RNAiMax转染试剂（由Life Technologies公司制造，产品目录编号：1401251)在Opti-MEM 培养基（由Life Technologies公司制造，产品目录编号：11058-021)中稀释，将20yL每种 siRNA/RNAiMax混合物添加到96孔培养板至双链核酸终浓度为100pM，混合物在37摄氏度 5%C02条件下培养24小时。之后，用roS(磷酸盐缓冲溶液)清洗细胞，使用Cells-to-Ct试剂 盒（由Applied Biosystems公司制备，产品目录编号:AM1728)根据随产品所附产品说明书 中记载的方法从各个培养板合成cDNA。将5μ1的该cDNA添加到MicroAmp Optical 96孔板 (由Applied Biosystems公司制备，产品目录编号:4326659)，然后添加10yL的TaqMan Gene Expression Master Mix(由Applied Biosystems公司制备，产品目录编号：4369016)、3yL 的UltraPure Distilled Water(由Life Technologies 公司制造，产品目录编号 No·: 10977-015)、lyL的人02GPI探针和lyL的人GAPDH探针。使用ABI7900HT实时PCR系统对人β 2GPI基因和人GAPDH(D-甘油醛-3-磷酸脱氢酶)进行实时PCLGAPDH是组成型表达的基因， 作为内部对照对其进行测定，对I32GPI表达水平进行归一化。将不添加 siRNA只用转染试剂 处理HepG2细胞时02GPI mRNA的量作为1.0,计算当引入各个siRNA时的02GPI mRNA相对表 达水平。本实验进行3次，02GPI mRNA相对表达水平的平均值示于表1-1至1-16。
[0130]此外，为了选择敲减活性高的双链核酸，将双链核酸终浓度降低至ΙΟρΜ，计算上述 相同实验体系中KGPI基因的相对表达量。结果如表2所示。
[0134] 委托Sigma Aldrich或者GeneDesign公司合成了SEQ ID N0:3542~3701 所示的核 糖核苷酸构成的有义链，SEQ ID NO:3702~3861所示的核糖核苷酸构成的反义链，以及它 们退火得到的双链核酸(AH1181~AH1340;SEQ ID Ν0:η~（n = 3542~3701)所示的有义链 与SEQ ID NO: [n+160]所示反义链配对）（参见表3-1至3-5,在表中，大写表示未经修饰的 RNA，小写表示2'-0_甲基修饰的RNA)。分别地，双链核酸编号AH1181~1204以SEQ ID N0: 2456中所示02GPI部分序列为靶序列，AH1205~1233以SEQ ID N0:2459中所示的02GPI部分 序列为靶序列，AH1234~1243以SEQ ID勵:2485中所示的026?1部分序列为靶序列，六!11244 ~1253以SEQIDN0:2486中所示的β2GPI部分序列为靶序列，AH1254~1263以SEQIDN0 : 3053中所示的02GPI部分序列为靶序列，AH1264~1271以SEQ ID N0:3185中所示的02GPI部 分序列为靶序列，AH1272~1282以SEQ ID觀：3239中所示的026?1部分序列为靶序列， AH1283~1297以SEQ ID N0:3303中所示的02GPI部分序列为靶序列，AH1298~1311以SEQ ID N0:3385中所示的02GPI部分序列为靶序列，AH1312~1316以SEQ ID N0:3398中所示的β 2GPI部分序列为靶序列，ΑΗ1317~1325以SEQ ID勵:3399中所示的拟6?1部分序列为靶序 列，以及AH1326~1340以SEQ ID NO :3499中所示的02GPI部分序列为靶序列。
[0135] 以与实施例2中相同的方法，计算出将这些双链核酸引入HepG2细胞、经过24小时 时的KGPI mRNA相对表达水平。其结果示于表3-1至3-5。
[0145] 本申请以在日本提交的专利申请No. 2014-7305(提交日2014年1月17日）为基础， 其内容全部并入本文。
[0146]本发明提供了具有抑制02GPI表达活性的核酸、包含该核酸作为活性成分的医药 组合物等。本发明的核酸和医药组合物抑制I32GPI的表达，可用于治疗或预防APS、SLE等自 身免疫病以及血液透析中的血栓。
【主权项】
1. 一种双链核酸，其降低02GPI基因的表达，所述双链核酸由有义链和反义链组成，所 述双链核酸包含至少11个碱基对的双链区，其中，所述反义链中的链长为至少17个核苷酸 且至多30个核苷酸的寡核苷酸链与选自表1-1至表1-16中所述的组中的靶标I32GPI mRNA序 列互补。2. 根据权利要求1所述的双链核酸，其中所述双链区为11~27个碱基对，与选自表1-1 至表1-16中所述的组中的靶标02GPI mRNA序列互补的所述反义链中，从5'端起算的第2个 核苷酸与该靶标KGPI mRNA序列的从3 '端起算的第2个脱氧核糖核苷酸互补。3. 根据权利要求1所述的双链核酸，其中所述有义链的3'端和所述反义链的5'端形成 平末端。4. 根据权利要求1所述的双链核酸，其中所述有义链为21个核苷酸长，并且所述反义链 为21个核苷酸长。5. 根据权利要求4所述的双链核酸，其降低02GPI基因的表达，其为含有19个碱基对的 双链区的经修饰双链核酸，所述双链区中的核苷酸中的40~65 %包含2 ' -0-甲基修饰核苷 酸。6. 根据权利要求1所述的双链核酸，其中所述反义链包含选自表1-1至1-16和表3-1至 3-5的"反义链"所记载的组。7. 根据权利要求1所述的双链核酸，其中所述有义链包含选自表1-1至1-16和表3-1至 3-5的"有义链"所记载的组。8. 根据权利要求1所述的双链核酸，其包含选自由表1-1至1-16和表3-1至3-5所记载的 有义链/反义链组成的组的1对有义链/反义链的序列。9. 根据权利要求1~8中任一项所述的双链核酸，其包含配体。10. -种单链核酸，其仅由权利要求1~9中任一项所述的双链核酸中的反义链组成。11. 医药组合物，其包含权利要求1~10中任一项所述的核酸。12. -种治疗抗02GPI抗体所介导疾病的方法，其包括下述步骤：向有此治疗需要的人 施用治疗有效量的权利要求1~10中任一项所述的核酸或者权利要求11所述的医药组合 物。13. 根据权利要求12所述的方法，其中，所述疾病是自身免疫病或者血栓。
【文档编号】C12N15/09GK105980560SQ201580004877
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2015年1月16日
【发明人】山田阳史, 岩井宏徒, 桝田和宏, 神田美菜子
【申请人】协和发酵麒麟株式会社