专利名称：抑制c-Met表达的siRNA及含有所述siRNA的抗癌组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种小干扰RNA(siRNA),其可以互补结合到c_Met转录本(mRNA转录本)的碱基序列上，从而抑制c-Met的表达且不引起免疫反应，本发明还涉及所述siRNA用于预防和/或治疗癌症的用途。
背景技术：
c-Met是一种编码被称为肝细胞生长因子受体(HGFR)的蛋白的原癌基因。1984年，c-Met首次在化学致癌物处理的人骨肉瘤中被发现。1986年，由于与tpr (易位启动子区)基因整合，c-Met被发现是潜在的原癌基因，(Cooper etal.，Nature，311，29-33，1984; Dean et al.，Mol cell Biol.，7，921-924，1987; Park etal·，Cell，45，895-904，1986)。
一旦和被称为c-Met的细胞表面受体酪氨酸激酶(TK)结合，由间充质细胞分泌的肝细胞生长因子(HGF)就会刺激细胞生长、细胞运动、胚胎发生、伤口愈合及血管生成。这些多能作用在发育、内环境平衡和组织再生中起基础性的重要作用。HGF信号传递还有助于几种人癌症中的癌发生和肿瘤发展，并且可促进肿瘤转移密切相关的攻击性细胞侵袭力。(Nakamura et al. , J Clin Invest.，106，1511-9，2000;Comoglio et al. , Semin Cancer Biol，11，153-65，2001;Boccaccio, Nat Rev Cancer, 6，637-45，2006;Huh CF et al.，ProcNatl Acad Sci USA,101，4477-82，2004)。大多数的HGF/c-Met信号转导异常来自于由HGF或c_Met过表达或突变导致的HGF或c-Met活性升高，并且已知这与多种癌症患者的不利预后密切相关。由于发现c-Met蛋白活性和癌症发生率/转移之间密切关系以及其他受体酪氨酸激酶抑制剂在临床上成功，对祀向c-Met的抗癌药物的开发有积极进展。但是，目前临床阶段的大多数候选药物是基于蛋白质或c-Met受体抗体的三级结构设计的化学合成抑制剂，例如抑制c-Met信号途径的酪氨酸激酶抑制剂。虽然低分子量的激酶抑制剂与靶向大量蛋白激酶的激酶抑制剂相比具有提高的对c-Met的选择性，但仍然顾虑由于脱靶至其他与c-Met结构相似的蛋白质而导致的副作用。虽然相比之下抗体药物有着极好的选择性，但仍然存在由复杂生产过程导致的生产率问题和储存过程中不稳定问题。因此，一直需求开发靶向c-Met功能的有效抑制剂。最近，人们发现核糖核酸介导的干扰(RNAi )可以通过引起甚至对现有技术来说还不是药物靶点的序列特异性基因沉默来帮助开发首要候选药物。因此，RNAi被认为是一种能够对靶点有限和合成药物非特异性问题提供解决方案且可以克服化学合成药物局限的技术。因而，许多关于RNAi在开发现有技术很难治疗的多种疾病尤其是癌症的药物中应用的研究取得了积极的进展。不过，已经发现siRNA (small interfering RNA)会引发固有的免疫反应,并且还会超预计地更频繁引起非特异性RNAi作用。
有报道显示，在哺乳动物细胞中，长的双链SiRNA可以诱导有害的干扰素反应；短的双链siRNA也可以诱导对人身体或细胞有害的始初干扰素反应；并且已经知道，许多siRNA会引起比预计更高的非特异性RNAi作用(Kleirman etal. Nature, 452:591-7，2008)。虽然已经尝试开发靶向在癌症发展中起重要作用的C-Met的siRNA抗癌药物，但到目前为止尚未取得显著成果。siRNA的个体序列的基因抑制效应还未被提出，尤其是免疫活性还未被考虑。虽然，siRNA由于其高活性、极好靶特异性等优点而显示出了作为新药的巨大前景，但是对于治疗性开发仍然有一些障碍需要克服，例如由于其可能被血液中的核酸酶降解而血稳定性低、由于带负电荷而穿过细胞膜的能力较弱、由于快速被排泄而在血液中的半存留期较短，从而其组织分布有限、并且可诱导能够作用于其他基因调节途径的脱靶效
应。 最近，为改善这些缺点并使之能应用到临床试验中，在siRNA中引入化学修饰的研究取得了一 定进展(Davidson, Nat. Biotechnol. , 24:951-952，2006; Sioud andFurset, J. Biomed. Biotechnol. , 2006:23429, 2006)。
发明内容
因此，发明人开发了具有高序列特异性并因此可特异性结合到靶基因的转录本以增强RNAi活性且不会诱导任何免疫毒性的siRNA，并完成了本发明。—实施方案提供了可互补结合到c-Met mRNA转录本并因此可特异性抑制c-Met合成和/或表达的siRNA。另一实施方案提供了用于表达所述siRNA的表达载体。另一个实施方案提供了抑制C-Met合成和/或表达的药物组合物，含有所述siRNA或所述siRNA表达载体作为活性成分。另一实施方案提供了含有所述siRNA或所述siRNA表达载体作为活性成分的抗癌组合物。另一实施方案提供了一种抑制C-Met合成和/或表达的方法,包括制备所述siRNA或所述siRNA表达载体；以及使所述siRNA或所述siRNA表达载体与表达c-Met的细胞相接触，并将所述siRNA和/或所述siRNA表达载体用于在表达c-Met的细胞中抑制c-Met的合成和/或表达。又一实施方案提供了一种抑制癌细胞生长的方法，包括制备所述siRNA或所述siRNA表达载体；以及使所述siRNA或所述siRNA表达载体与表达c-Met的细胞相接触，并将所述siRNA或所述siRNA表达载体用于在表达c-Met的癌细胞中抑制癌细胞生长。又一实施方案提供了一种预防和/或治疗癌症的方法，包括制备所述siRNA或所述siRNA表达载体；以及将所述siRNA或所述siRNA表达载体以有效治疗剂量给予患者，并将所述siRNA或所述siRNA表达载体用于预防和/或治疗癌症。
图Ia到图Id显示了 siRNA处理的细胞因子浓度变化，其中Ia表示α -干扰素的浓度，Ib表示γ -干扰素的浓度，Ic表示白介素-12的浓度，Id表示肿瘤坏死因子的浓度。
具体实施例方式本发明提供了可互补结合到c-Met mRNA转录本的碱基序列并因此抑制所述细胞中c-Met合成和/或表达的siRNA、含有所述siRNA的药物组合物以及其用途。本发明一方面提供了特异性抑制c-Met合成和/或表达的siRNA。另一方面提供了抑制c-Met合成和/或表达的药物组合物，含有特异性抑制c-Met合成和/或表达的siRNA作为活性成分。另一方面提供了抑制癌细胞生长的药剂或预防和/或治疗癌症的药物组合物(抗癌组合物)，含有可特异性抑制c-Met合成和/或表达的siRNA作为活性成分。本发明涉及抑制哺乳动物包括人体内c-Met mRNA、其可变剪接形式或变体或者相同谱系c-Met基因的表达的技术，这可以通过给予患者某一量的本发明siRNA以减少靶mRNA来实现。以下将详细描述本发明。 c-Met可以源自于哺乳动物，优选人，或者它可以是与人相同谱系的c_Met或其突变体。术语“与人相同谱系”是指具有与人c-Met基因或源自其的mRNA有80%或更大序列同源性的基因或mRNA的哺乳动物，具体地，它可以包括人、灵长类、啮齿类等。根据一个实施方案，对应于编码c-Met的mRNA的正义链的cDNA序列可以是SEQID NO I。本发明的SiRNA可以靶向对应于选自由以下序列组成的区域的至少一个碱基序列的mRNA或cDNA区域c_Met的mRNA或cDNA中的连续15_25bp，优选连续18_22bp，优选连续2-21bp。cDNA上优选的靶点区域总结在下表I中。因此，本发明的一个实施方案提供了靶向对应于选自SEQ ID NO: I的c-Met cDNA区域中SEQ ID NO. 2到21的至少一个碱基序列的mRNA或cDNA区域的siRNA。具体地，提供了靶向对应于选自SEQ ID N0.3、18和21的碱基序列的mRNA区域的siRNA。表lc_Met cDNA 上的靶区域(SEQ ID NO: I) (20)
权利要求
1.一种15到30bp的双链SiRNA (小干扰RNA)，其可靶向对应于选自下表1_1中描述的c-Met cDNA区域的至少一个的mRNA区域
2.权利要求I的siRNA，其中所述siRNA可靶向对应于选自SEQID NO 3、18和21的至少一个碱基序列的mRNA区域。
3.权利要求I的siRNA，其中所述siRNA在3’末端、5’末端或两个末端包含由I到5个核苷酸组成的悬突。
4.权利要求2的siRNA，其中所述siRNA包括选自下表6中描述的siRNAI到23的核苷酸序列 表6
5.权利要求4的siRNA，其中所述siRNA选自 siRNA 2，其包含SEQ ID NO. 24的正义序列和SEQ ID NO. 25的反义序列； siRNA 17，其包含SEQ ID NO. 54的正义序列和SEQ ID NO. 55的反义序列； siRNA 20，其包含SEQ ID NO. 60的正义序列和SEQ ID NO. 61的反义序列； siRNA 21，其包含SEQ ID NO. 62的正义序列和SEQ ID NO. 25的反义序列； siRNA 22，其包含SEQ ID NO. 63的正义序列和SEQ ID NO. 55的反义序列；以及 siRNA 23，其包含SEQ ID NO. 64的正义序列和SEQ ID NO. 61的反义序列。
6.权利要求I的siRNA，其中至少一个核糖核苷酸的糖或碱基结构或者核糖核苷酸之间的键被化学修饰。
7.权利要求6的siRNA，其中所述化学修饰是以硼烷磷酸键或磷硫酰键修饰3’末端、5’末端或两末端的磷酸二酯键。
8.权利要求6的siRNA，其中所述化学修饰是在3’末端、5’末端或两末端引入ENA(乙烯桥接核酸)。
9.权利要求6的siRNA，其中所述化学修饰是以选自_NH2(氨基)、-C-烯丙基、-F(氟基)和-O-Me (甲基)的至少一个取代核糖环的2’ -OH (羟基)。
10.权利要求6的siRNA，其中所述化学修饰siRNA包括选自下表11_1中描述的siRNA24-40中的核苷酸序列 表11-1
11.一种表达载体，其包含权利要求1-10任一项的SiRNA。
12.权利要求11的表达载体，其中所述表达载体选自质粒、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、痘苗病毒载体和溶瘤腺病毒载体。
13.一种抗癌组合物，其含有权利要求1-10任一项的siRNA作为活性成分。
14.权利要求13的抗癌组合物，其包括与核酸递送系统的复合物形式的siRNA。
15.权利要求14的抗癌组合物，其中所述核酸递送系统选自病毒载体、非病毒载体、月旨质体、阳离子聚合物、微团、乳剂和固态脂质纳米颗粒。
16.权利要求13的抗癌组合物，还包括抗癌化学治疗物，或 抑制选自生长因子、生长因子受体、下游信号转导蛋白、病毒癌基因和抗癌剂抗性基因的一个的表达的siRNA。
17.一种抑制c-Met合成和/或表达的方法，包括制备权利要求1-10任一项的siRNA ；使所述siRNA与表达c-Met的细胞相接触。
18.—种抑制癌细胞生长的方法，包括制备权利要求1-10任一项的siRNA ;使所述siRNA与表达c-Met的癌细胞相接触。
19.一种预防和/或治疗癌症的方法，包括制备权利要求1-10任一项的siRNA ;将所述siRNA以治疗有效量给予患者。
全文摘要
公开了一种可互补结合到c-Met转录本(mRNA转录本)从而抑制c-Met表达而不引起免疫应答的小干扰RNA(siRNA)，以及所述siRNA用于预防和/或治疗癌症的用途。可互补结合到编码c-Met的mRNA的该siRNA可以通过RNA干扰(RNAi)来抑制在几乎所有癌细胞中共同过表达的c-Met的表达，从而抑制癌细胞的增殖和转移，因此所述siRNA可以用作抗癌剂。
文档编号C12N15/11GK102782133SQ201080065020
公开日2012年11月14日 申请日期2010年12月28日 优先权日2009年12月31日
发明者印昌勋, 赵恩娥, 金善玉, 金详熹 申请人:株式会社三养生物制药