一种抑制鸡B淋巴细胞CD86基因表达的siRNA及其应用
一种抑制鸡B淋巴细胞CD86基因表达的siRNA及其应用
【技术领域】
[00011 本发明涉及一种抑制鸡B淋巴细胞⑶86基因表达的siRNA，同时还涉及该siRNA的 应用，属于分子生物学技术领域。
【背景技术】
[0002] 1993年13〇丨8 8〇口1:丨8等发现了137家族的第二个成员0)86(137-2)分子，同年？代61]1已11 等克隆出了⑶86的基因。CD86是表达在抗原提呈细胞(antigen presenting cell，APC)表 面的共同刺激性配体，是免疫超家族成员之一。CD86由1120bp基因所编码，其基因序列与 ⑶80有26 %的同源性，其中包含一个由981个核苷酸组成的开放阅读框，氨基端有一个分泌 性信号肽，推测其整个蛋白由306个氨基酸组成，属于I型跨膜糖蛋白。修饰之前CD86的分子 量约为34kD，包含一个由220个氨基酸组成的胞膜外区，一个由23个氨基酸组成的疏水性跨 膜区和一个由60个氨基酸组成的胞浆区。其中，胞膜外区包含一个免疫球蛋白超家族V样区 和C样区，含有8个潜在的N连接糖基化位点；胞浆区有PKC和酪蛋白激酶II的潜在磷酸化位 点，提示CD86可能有信号转导功能。CD86可以在各种APC表面以单体的形式表达，如树突状 细胞(DC)、朗格汉斯细胞、活化的巨噬细胞、B细胞等，其一般呈低水平组成性表达，活化后 可快速上调。
[0003] CD86可以与T细胞共刺激受体CD28和细胞毒性T细胞相关抗原4(cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4，CTLA_4)结合。CD86与CD28/CTLA-4结合后，与CD80协 同刺激⑶4+Thl和Th2型细胞的表达，且对Th2型T细胞的作用大于Thl型。Thl型细胞主要分 泌IL-2、IFN-y、TNF-a等I型细胞因子，参与细胞毒性T细胞(CTL)介导的细胞免疫，Th2型细 胞主要分泌11-4、几-5、11^-6、几-10、几-13等11型细胞因子，其功能在于刺激8细胞增殖及 嗜酸性粒细胞活化，促进抗体(IgG、IgE)的产生，参与体液免疫。总之，CD86在调节机体免疫 应答中具有重要作用。
[0004] RNA干扰(RNA 11^奸6代1^，1?祖1)现象，也称依赖于1?祖的基因沉默机制，是指由 双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)介导的特异性抑制与其序列同源的靶基因 mRNA表 达的现象。2001年Elbashir等在哺乳动物细胞中首次观测到RNAi现象，由于RNAi技术易于 制备特定基因缺失表型个体，可方便快捷地研究该基因的功能，因而被广泛应用于基因功 能和基因治疗研究领域。研究发现，小干扰RNA(smal 1 interfering RNA，siRNA)能在哺乳 动物细胞中诱导特异性基因沉默。
[0005] siRNA具有RNA双链结构和3 '端双核苷酸悬垂，较难被核酶降解，作为基因沉默工 具具有较好的稳定性和优越的抑制效果，已被广泛应用于功能基因组学研究。DT40细胞由 禽白血病病毒(avian leucosis virus，ALV)诱导分化，来源于鸡前B淋巴细胞的一个肿瘤 细胞系，该细胞表面携带mlgM，并且具有与鸡法氏囊前B淋巴细胞完全相同的生物学特征， 因此可以作为良好的禽B淋巴细胞模型开展相关的研究。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种抑制鸡B淋巴细胞⑶86基因表达的siRNA。
[0007] 同时，本发明还提供一种⑶86siRNA的应用。
[0008]为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：
[0009] 一种抑制鸡B淋巴细胞⑶86基因表达的siRNA，其正义链序列如SEQ ID NO: 1所示， 反义链序列如SEQ ID NO:2所示。
[0010]为提高siRNA的基因干扰效率，在siRNA序列的3'端垂悬有两个由脱氧核苷组成的 碱基TT(即dTdT)。该垂悬不与mRNA序列互补，能使正义链3'端更容易解链，从而增加其沉默 效率。
[0011] siRNA的应用，具体为siRNA在制备抑制鸡B淋巴细胞⑶86基因表达的药物中的应 用。所述鸡B淋巴细胞为鸡DT40细胞。
[0012] 进一步的，SiRNA在制备抑制法氏囊活性肽囊素(BS)促鸡DT40细胞mlgM抗体mRNA 表达的药物中的应用。
[0013] 更进一步的，siRNA在制备抗禽B淋巴细胞活化(或发育分化)的免疫抑制剂中的应 用。
[0014] 本发明的有益效果：
[0015] 本发明根据鸡B淋巴细胞⑶86mRNA序列设计并合成小分子干扰RNA(序列如SEQ ID NO: 1~2所示），该CD86siRNA能有效抑制鸡DT40细胞CD86mRNA与CD86蛋白的表达，在干扰鸡 ⑶86基因表达后，法氏囊活性肽囊素促鸡DT40细胞表面膜IgM(mlgM)抗体mRNA的表达水平 显著降低，其在制备抗禽B淋巴细胞活化(或发育分化）的免疫抑制剂方面具有良好的应用 前景。
【附图说明】
[0016] 图1为荧光定量PCR检测鸡DT40细胞⑶86mRNA的表达水平；
[0017] 图2为Western blotting检测鸡DT40细胞CD86蛋白的表达水平；
[0018] 图3为荧光定量PCR检测BS对鸡DT40细胞mlgM抗体mRNA表达水平的影响；
[0019] 图4为荧光定量PCR检测CD86siRNA干扰后BS对鸡DT40细胞mlgM抗体mRNA表达水平 的影响。
【具体实施方式】
[0020] 下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
[0021] 实施例1
[0022] 抑制鸡B淋巴细胞⑶86基因表达的siRNA，其正义链序列如SEQ ID NO: 1所示，反义 链序列如SEQ ID N0:2所示，在siRNA序列的3'端垂悬有dTdT。
[0023] 试验例
[0024] l、CD86siRNA抑制鸡B淋巴细胞CD86基因的表达
[0025] l)CD86siRNA的设计与合成
[0026] 根据GenBank基因库中鸡B淋巴细胞CD86已知mRNA序列（NM_KU284846)，按照siRNA 设计原则，利用Ambion公司的siRNA设计软件针对编码区siRNA革E点位置设计如下序列：
[0027] 正义链：5 ' -GCAGAUGAUUUGGCUAAUU-3 '，
[0028] 反义链：5 ' -AAUUAGCCAAAUCAUCUGC-3 '。
[0029] CD86siRNA序列由上海吉玛制药技术有限公司合成。为提高siRNA的基因干扰效 率，在⑶86siRNA序列的3'端垂悬有两个由脱氧核苷组成的碱基TT。
[0030] 2)荧光定量PCR检测鸡DT40细胞⑶86mRNA的表达水平
[0031] 鸡DT40细胞购自广州吉尼欧生物科技有限公司，将鸡DT40细胞接种于含10%FBS 的1640培养基中，置于37 °C、5 % C02中培养，每2天换液1次。待鸡DT40细胞培养至3 X 106/mL， 分装于24孔细胞培养板中，每孔400yL，转染前更换新鲜培养基。实验分为CD86siRNA组、随 机对照组（SCR)和空白对照组(contro 1)，随机对照组采用随机序列的RNA双链(scramble， SCR)，购自上海吉玛制药技术有限公司，目录号:A06001。用Lipofectamine? 2000转染试剂 盒（Invitrogen公司）按照试剂盒说明书转染⑶86siRNA和随机对照，⑶86siRNA组、随机对 照组的核酸转染终浓度为100nm 〇l/L，空白对照组加入与药物等体积（100yL)的无血清1640 培养基，转染终体积500yL。转染后的鸡DT40细胞继续培养48h，用总RNA提取试剂盒(Qiagen 公司）提取各组细胞总RNA，提取的总RNA用紫外
【技术领域】
[00011 本发明涉及一种抑制鸡B淋巴细胞⑶86基因表达的siRNA，同时还涉及该siRNA的 应用，属于分子生物学技术领域。
【背景技术】
[0002] 1993年13〇丨8 8〇口1:丨8等发现了137家族的第二个成员0)86(137-2)分子，同年？代61]1已11 等克隆出了⑶86的基因。CD86是表达在抗原提呈细胞(antigen presenting cell，APC)表 面的共同刺激性配体，是免疫超家族成员之一。CD86由1120bp基因所编码，其基因序列与 ⑶80有26 %的同源性，其中包含一个由981个核苷酸组成的开放阅读框，氨基端有一个分泌 性信号肽，推测其整个蛋白由306个氨基酸组成，属于I型跨膜糖蛋白。修饰之前CD86的分子 量约为34kD，包含一个由220个氨基酸组成的胞膜外区，一个由23个氨基酸组成的疏水性跨 膜区和一个由60个氨基酸组成的胞浆区。其中，胞膜外区包含一个免疫球蛋白超家族V样区 和C样区，含有8个潜在的N连接糖基化位点；胞浆区有PKC和酪蛋白激酶II的潜在磷酸化位 点，提示CD86可能有信号转导功能。CD86可以在各种APC表面以单体的形式表达，如树突状 细胞(DC)、朗格汉斯细胞、活化的巨噬细胞、B细胞等，其一般呈低水平组成性表达，活化后 可快速上调。
[0003] CD86可以与T细胞共刺激受体CD28和细胞毒性T细胞相关抗原4(cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4，CTLA_4)结合。CD86与CD28/CTLA-4结合后，与CD80协 同刺激⑶4+Thl和Th2型细胞的表达，且对Th2型T细胞的作用大于Thl型。Thl型细胞主要分 泌IL-2、IFN-y、TNF-a等I型细胞因子，参与细胞毒性T细胞(CTL)介导的细胞免疫，Th2型细 胞主要分泌11-4、几-5、11^-6、几-10、几-13等11型细胞因子，其功能在于刺激8细胞增殖及 嗜酸性粒细胞活化，促进抗体(IgG、IgE)的产生，参与体液免疫。总之，CD86在调节机体免疫 应答中具有重要作用。
[0004] RNA干扰(RNA 11^奸6代1^，1?祖1)现象，也称依赖于1?祖的基因沉默机制，是指由 双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)介导的特异性抑制与其序列同源的靶基因 mRNA表 达的现象。2001年Elbashir等在哺乳动物细胞中首次观测到RNAi现象，由于RNAi技术易于 制备特定基因缺失表型个体，可方便快捷地研究该基因的功能，因而被广泛应用于基因功 能和基因治疗研究领域。研究发现，小干扰RNA(smal 1 interfering RNA，siRNA)能在哺乳 动物细胞中诱导特异性基因沉默。
[0005] siRNA具有RNA双链结构和3 '端双核苷酸悬垂，较难被核酶降解，作为基因沉默工 具具有较好的稳定性和优越的抑制效果，已被广泛应用于功能基因组学研究。DT40细胞由 禽白血病病毒(avian leucosis virus，ALV)诱导分化，来源于鸡前B淋巴细胞的一个肿瘤 细胞系，该细胞表面携带mlgM，并且具有与鸡法氏囊前B淋巴细胞完全相同的生物学特征， 因此可以作为良好的禽B淋巴细胞模型开展相关的研究。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种抑制鸡B淋巴细胞⑶86基因表达的siRNA。
[0007] 同时，本发明还提供一种⑶86siRNA的应用。
[0008]为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：
[0009] 一种抑制鸡B淋巴细胞⑶86基因表达的siRNA，其正义链序列如SEQ ID NO: 1所示， 反义链序列如SEQ ID NO:2所示。
[0010]为提高siRNA的基因干扰效率，在siRNA序列的3'端垂悬有两个由脱氧核苷组成的 碱基TT(即dTdT)。该垂悬不与mRNA序列互补，能使正义链3'端更容易解链，从而增加其沉默 效率。
[0011] siRNA的应用，具体为siRNA在制备抑制鸡B淋巴细胞⑶86基因表达的药物中的应 用。所述鸡B淋巴细胞为鸡DT40细胞。
[0012] 进一步的，SiRNA在制备抑制法氏囊活性肽囊素(BS)促鸡DT40细胞mlgM抗体mRNA 表达的药物中的应用。
[0013] 更进一步的，siRNA在制备抗禽B淋巴细胞活化(或发育分化)的免疫抑制剂中的应 用。
[0014] 本发明的有益效果：
[0015] 本发明根据鸡B淋巴细胞⑶86mRNA序列设计并合成小分子干扰RNA(序列如SEQ ID NO: 1~2所示），该CD86siRNA能有效抑制鸡DT40细胞CD86mRNA与CD86蛋白的表达，在干扰鸡 ⑶86基因表达后，法氏囊活性肽囊素促鸡DT40细胞表面膜IgM(mlgM)抗体mRNA的表达水平 显著降低，其在制备抗禽B淋巴细胞活化(或发育分化）的免疫抑制剂方面具有良好的应用 前景。
【附图说明】
[0016] 图1为荧光定量PCR检测鸡DT40细胞⑶86mRNA的表达水平；
[0017] 图2为Western blotting检测鸡DT40细胞CD86蛋白的表达水平；
[0018] 图3为荧光定量PCR检测BS对鸡DT40细胞mlgM抗体mRNA表达水平的影响；
[0019] 图4为荧光定量PCR检测CD86siRNA干扰后BS对鸡DT40细胞mlgM抗体mRNA表达水平 的影响。
【具体实施方式】
[0020] 下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
[0021] 实施例1
[0022] 抑制鸡B淋巴细胞⑶86基因表达的siRNA，其正义链序列如SEQ ID NO: 1所示，反义 链序列如SEQ ID N0:2所示，在siRNA序列的3'端垂悬有dTdT。
[0023] 试验例
[0024] l、CD86siRNA抑制鸡B淋巴细胞CD86基因的表达
[0025] l)CD86siRNA的设计与合成
[0026] 根据GenBank基因库中鸡B淋巴细胞CD86已知mRNA序列（NM_KU284846)，按照siRNA 设计原则，利用Ambion公司的siRNA设计软件针对编码区siRNA革E点位置设计如下序列：
[0027] 正义链：5 ' -GCAGAUGAUUUGGCUAAUU-3 '，
[0028] 反义链：5 ' -AAUUAGCCAAAUCAUCUGC-3 '。
[0029] CD86siRNA序列由上海吉玛制药技术有限公司合成。为提高siRNA的基因干扰效 率，在⑶86siRNA序列的3'端垂悬有两个由脱氧核苷组成的碱基TT。
[0030] 2)荧光定量PCR检测鸡DT40细胞⑶86mRNA的表达水平
[0031] 鸡DT40细胞购自广州吉尼欧生物科技有限公司，将鸡DT40细胞接种于含10%FBS 的1640培养基中，置于37 °C、5 % C02中培养，每2天换液1次。待鸡DT40细胞培养至3 X 106/mL， 分装于24孔细胞培养板中，每孔400yL，转染前更换新鲜培养基。实验分为CD86siRNA组、随 机对照组（SCR)和空白对照组(contro 1)，随机对照组采用随机序列的RNA双链(scramble， SCR)，购自上海吉玛制药技术有限公司，目录号:A06001。用Lipofectamine? 2000转染试剂 盒（Invitrogen公司）按照试剂盒说明书转染⑶86siRNA和随机对照，⑶86siRNA组、随机对 照组的核酸转染终浓度为100nm 〇l/L，空白对照组加入与药物等体积（100yL)的无血清1640 培养基，转染终体积500yL。转染后的鸡DT40细胞继续培养48h，用总RNA提取试剂盒(Qiagen 公司）提取各组细胞总RNA，提取的总RNA用紫外
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0访客 来自[江苏省常州市电信] 2019年05月22日 08:38现在在生物研究上使用的还是挺多的，将小核酸试剂转入到细胞的体内，最近我们实验室在转染A549细胞时，是师兄推荐使用的RFECT,转染下来效果还是不错的，毒性比我们之前使用的小很多。
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