专利名称：一种两亲性高分子阳离子聚合物的应用的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，涉及一种两亲性高分子阳离子聚合物作
为siRNA转染载体及用法。
背景技术：
RNA干扰现象是利用siRNA靶向实现转录后水平基因沉默的现 象，RNAi是通过siRNA介导的特异性高效抑制基因表达途径，由 siRNA介导识别并耙向切割同源性靶mRNA。 siRNA基因沉默技术 是治疗各种基因相关疾病的最有效方法[1—6]。
研究表明，人工合成的具有21 22个核苷酸序列的siRNA没有细 胞毒性，并且能够有效的实现RNA干扰并达到基因治疗的目的7—9。 尽管如此，由于siRNA本身不能进入靶向进入病变组织的功能，在临 床应用方面受到了极大的制约1()—12。近年来，非病毒类阳离子基因 载体已经应用在了siRNA传递体系中，如PEG-PLL和PEG-PEI"3—141 。
PEI类载体已经被证明了在质粒转染体系中具有很好的效果，并 在siRNA转染方面也起到一定的作用，但是聚阳离子带有的大量的正 电荷，当剂量增大时会与细胞表面有强烈的作用而导致细胞死亡，因 此，在PEI表面进行修饰遮蔽一部分正电荷能够有效的降低细胞毒性
15-18
发明内容
本发明的目的是寻找低毒性，转染效率高，靶向性和pH敏感性强的非病毒类基因载体。
本发明选用超支化聚乙烯亚胺改性的超支化聚乙烯亚胺(PEI)-聚谷氨酸苄酯(PBLG)的共聚物PEI-PBLG ，选取PEI-25k和 Lipofectamine2000作为对照，介导荧光素酶siRNA进行基因沉默。我 们发现PEI-PBLG相对PEI-25k能够有效提高siRNA沉默效率，并降低
了细胞毒性。
本发明提供了一种两亲性高分子阳离子聚合物的应用，其特征在 于，所述的一种两亲性高分子阳离子聚合物作为siRNA转染载体；
所述的两亲性高分子阳离子聚合物是分子量为25000的超支化 聚乙烯亚胺(PEI)与聚谷氨酸苄酯(PBLG)的共聚物PEI-PBLG， 其中，所述的超支化聚乙烯亚胺与聚谷氨酸苄酯的质量比为6:4;所 述的两亲性高分子阳离子聚合物的尺寸为150-250nm;
所述的siRNA为沉默荧光素酶的Luc siRNA，其序列为 5' -CUUACGCUGAGUACUUCGAdTdT-3'。对照物为Rev siRNA， 其序列为5, -AGCUUCAUGAGUCGCAUUCdTdT-3'。
所述的一种两亲性高分子阳离子聚合物的制法用参考文献[19] 提供的方法制备。
本发明提供的一种两亲性高分子阳离子聚合物作为siRNA转染
载体的用法，步骤和条件如下
(1) 用常规方法合成siRNA;
(2) 两亲性高分子阳离子聚合物/siRNA复合颗粒的制备 取所述的两亲性高分子阳离子聚合物加水溶解至浓度为lmg/mL，用孔径为0.22nm的微孔滤膜过滤除菌；用无菌蒸馏水配制浓度为O.lmg/mL的siRNA水溶液，按照所述的两亲性高分子阳离子聚合物siRNA的质量比为1.25:1-40:1，将所述的两亲性高分子阳离子聚合物的水溶液和siRNA水溶液按上述溶质质量比混合，把该混合水溶液置室温放置20分钟，进一步促进两亲性高分子阳离子聚合物与siRNA复合物颗粒的形成，得到一种含两亲性高分子阳离子聚合物/siRNA复合物颗粒；
(3) —种两亲性高分子阳离子聚合物作为siRNA转染载体
(1) 细胞的培养
复苏细胞，在含有体积分数为10。/。的小牛血清的DMEM细胞培养液中并在含体积百分数为5%的C02、温度为37。C的孵箱中连续培养；
(2) 体外转染
转染前24小时内，将细胞按lxlO"个细胞/孔种于96孔细胞培养板中，置于含体积百分数为5%的C02、温度为37-C的孵箱中连续培养至80~90%融合；转染时，吸弃前一天加注的细胞培养板中的培养液，用PBS洗涤两次后，加入两亲性高分子阳离子聚合物/siRNA复合颗粒，以及含有体积百分数为10%FBS的高糖DMEM培养液，继续培养24小时，加入复合颗粒6h换液作为对照实验。
(3) 体外转染效率的测定
取出培养板，吸去培养液，PBS洗涤2次，加入5(HiL细胞裂解液裂解，吹打均匀后取出20pL至1.5mL离心管中，然后加入lOOpL荧光素底物，用光度计测定转染效率；
再取出20nL裂解液至新96孔板，选用美国Pierce公司BCA蛋白检测试剂盒，加入200PL检测液，37'C孵育30分钟后，酶标仪562nm波长检测。
有益效果本发明提供了一种两亲性高分子阳离子聚合物作为siRNA转染载体及用法。本发明的两亲性高分子阳离子聚合物是一种非病毒类基因载体。其基因沉默效率高，且细胞毒性小。对恒定表达荧光素酶的CT26细胞的最高基因沉默效率为73.4%，相对于商品化的PEI-25k的10.1%和脂质体2000的34.5%有较大的提高，且明显的降低了细胞毒性。在转染后6h换液实验中，对恒定表达荧光素酶的4T1细胞的最高转染效率为63.7%，相对于商品化的PEI-25k的14.5%和脂质体2000的20.5%亦有较大提高，同时也显示出其低毒性的特点。在瞬时转染的Hela细胞实验中，该两亲性高分子阳离子聚合物相对于商品化的PEI-25k和脂质体2000有较高的基因沉默效率和较小的细胞毒性。转染后6h不换液对照试验中，该两亲性高分子阳离子聚合物细胞毒性降低较小，而商品化的PEI-25k和脂质体2000降低相对较大。
图1是脂质体2000，即Lip 2000， PEI-25k和PEI-PBLG介导沉默荧光素酶的Luc siRNA和Rev siRNA在恒定表达荧光素酶的CT26细胞内的释放，转染后6h换液。横坐标表示材料与siRNA的质量比，siNRA的终浓度为2ng尔L。转染24h后检测荧光素酶表达量。图2是脂质体2000，即Lip 2000， PEI-25k和PEI-PBLG介导沉默荧光素酶的Luc siRNA和Rev siRNA在恒定表达荧光素酶的CT26细胞内的释放，转染后6h不换液。横坐标表示材料与siRNA的质量比，siNRA的终浓度为2ng/pL。转染24h后检测荧光素酶表达量。
图3是脂质体2000，即Lip 2000， PEI-25k和PEI-PBLG介导沉默荧光素酶的Luc siRNA和Rev siRNA在恒定表达荧光素酶的4T1细胞内的释放，转染后6h换液。横坐标表示材料与siRNA的质量比，siNRA的终浓度为2ng尔L。转染24h后检测荧光素酶表达量。
图4是脂质体2000，即Lip 2000， PEI-25k和PEI-PBLG介导沉默荧光素酶的Luc siRNA和Rev siRNA在恒定表达荧光素酶的4T1细胞内的释放，转染后6h不换液。横坐标表示材料与siRNA的质量比，siNRA的终浓度为2ng/pL。转染24h后检测荧光素酶表达量。
图5是脂质体2000，即Lip 2000， PEI-25k和PEI-PBLG介导沉默荧光素酶的Luc siRNA和Rev siRNA在瞬时表达荧光素酶的Hela细胞内的释放，转染后6h换液。横坐标表示材料与siRNA的质量比，siNRA的终浓度为2ng/pL。转染24h后检测荧光素酶表达量。
图6是脂质体2000，即Lip 2000， PEI-25k和PEI-PBLG介导沉默荧光素酶的Luc siRNA和Rev siRNA在瞬时表达荧光素酶的Hela细胞内的释放，转染后6h不换液。横坐标表示材料与siRNA的质量比，siNRA的终浓度为2ng/pL。转染24h后检测荧光素酶表达量。
具体实施例方式
实施例1:利用两亲性高分子阳离子聚合物介导沉默荧光素酶的Luc siRNA和阴性对照Rev siRNA对恒定表达荧光素酶的CT26细胞的体外转染
(1) 用常规方法合成siRNA;
(2) 两亲性高分子阳离子聚合物/siRNA复合颗粒的制备取所述的两亲性高分子阳离子聚合物加水溶解至浓度为
lmg/mL，用孔径为0.22nm的微孔滤膜过滤除菌；用无菌蒸馏水配制浓度为O.lmg/mL的siRNA水溶液，按照所述的两亲性高分子阳离子聚合物siRNA的质量比为1.25:1、 2.5:1、 5:1、 10:1、 20:1和40:1，将所述的两亲性高分子阳离子聚合物的水溶液和siRNA水溶液按上述溶质质量比混合，把该混合水溶液置室温放置20分钟，进一步促进两亲性高分子阳离子聚合物与siRNA复合物颗粒的形成，得到一种含两亲性高分子阳离子聚合物/siRNA复合物颗粒；
(3) —种两亲性高分子阳离子聚合物作为siRNA转染载体
(1) 细胞的培养
复苏恒定表达荧光素酶的CT26细胞，在含有体积分数为10%的小牛血清的高糖DMEM细胞培养液中并在含体积百分数为5%的C02、温度为37。C的孵箱中连续培养；
(2) 体外转染
转染前24小时内，将细胞按^104个细胞/孔种于96孔细胞培养板中，置于含体积百分数为5%的C02、温度为37'C的孵箱中连续培养至80~90%融合；转染时，吸弃前一天加注的细胞培养板中的培养液，用PBS洗涤两次后，加入两亲性高分子阳离子聚合物/siRNA复合颗粒，以及含有体积百分数为10% FBS的高糖DMEM培养液， 继续培养24小时，加入复合颗粒6h换液作为对照实验。 (3)体外转染效率的测定
取出培养板，吸去培养液，PBS洗涤2次，加入50pL细胞裂解 液裂解，吹打均匀后取出2(HiL至1.5mL离心管中，然后加入10(HiL 荧光素底物，用光度计测定转染效率；
再取出20pL裂解液至新96孔板，选用美国Pierce公司BCA蛋 白检测试剂盒，加入200WL检测液，37'C孵育30分钟后，酶标仪562nm 波长检测。
图1,2分别给出了两亲性高分子阳离子聚合物/siRNA复合物对 恒定表达荧光素酶CT26细胞转染6小时后换液与不换液的基因沉默 效率实验结果
由图1可见，荧光素酶荧光强度活性的测定取决于Luc siRNA和 Rev siRNA，其中Luc siRNA能与耙向mRNA特异性结合，而Rev siRNA作为阴性对照不能与耙向mRNA特异性结合。未加聚合物和 siRNA的细胞作为阳性对照。荧光强度的降低取决于加入了 Luc siRNA而不是阴性对照Rev siRNA，如果加入两种siRNA细胞的荧 光强度均降低了，则是由于载体的毒性而导致了细胞死亡。在不产生 细胞毒性条件下，单纯PEI-25k介导的siRNA基因沉默效率不高，最 高只能达到10.1%，只加siRNA不产生基因沉默，脂质体2000介导 siRNA效果比较明显，能够产生将近34.5%的沉默效率，但是可以看 出脂质体2000细胞毒性较大，而PEI-PBLG介导的siRNA基因传最高能产生73.4%基因沉默效率，且其毒性较小。
由图2可见，转染6小时不换液后载体的毒性均略有增加，脂质 体2000和PEI-25k增加较快，PEI-PBLG基因沉默效率最高，能达到 75.2%，而脂质体和PEI-25k分别为55.5%和12.6%，只加siRNA没
有沉默效果。
实施例2:利用两亲性高分子阳离子聚合物介导沉默荧光素酶的 Luc siRNA和阴性对照RevsiRNA对恒定表达荧光素酶的4Tl细胞的
体外转染
(1) 用常规方法合成siRNA;
(2) 两亲性高分子阳离子聚合物/siRNA复合颗粒的制备 取所述的两亲性高分子阳离子聚合物加水溶解至浓度为
lmg/mL，用孔径为0.22jim的微孔滤膜过滤除菌；用无菌蒸馏水配制 浓度为0.1mg/mL的siRNA水溶液，按照所述的两亲性高分子阳离子 聚合物siRNA的质量比为1.25:1、 2.5:1、 5:1、 10:1、 20:1和40:1， 将所述的两亲性高分子阳离子聚合物的水溶液和siRNA水溶液按上 述溶质质量比混合，把该混合水溶液置室温放置20分钟，进一步促 进两亲性高分子阳离子聚合物与siRNA复合物颗粒的形成，得到一 种含两亲性高分子阳离子聚合物/siRNA复合物颗粒；
(3) —种两亲性高分子阳离子聚合物作为siRNA转染载体 (1)细胞的培养
复苏恒定表达荧光素酶的4T1细胞，在含有体积分数为10%的 小牛血清的低糖DMEM细胞培养液中并在含体积百分数为5%的C02、温度为37'C的孵箱中连续培养；
(2) 体外转染
转染前24小时内，将4T1细胞按1"04个细胞/孔种于96孔细 胞培养板中，置于含体积百分数为5%的C02、温度为37'C的孵箱 中连续培养至80~90%融合；转染时，吸弃前一天加注的细胞培养板 中的培养液，用PBS洗涤两次后，加入两亲性高分子阳离子聚合物 /siRNA复合颗粒，以及含有体积百分数为10% FBS的低糖DMEM 培养液，继续培养24小时，加入复合颗粒6h换液作为对照实验。
(3) 体外转染效率的测定
取出培养板，吸去培养液，PBS洗涤2次，加入5(HiL细胞裂解 液裂解，吹打均匀后取出2(HiL至1.5mL离心管中，然后加入10(HiL 荧光素底物，用光度计测定转染效率。
再取出20pL裂解液至新96孔板，选用美国Pierce公司BCA蛋 白检测试剂盒，加入200WL检测液，37-C孵育30分钟后，酶标仪562nm 波长检测。
图3,4分别给出了两亲性高分子阳离子聚合物/siRNA复合物对 恒定表达荧光素酶4T1细胞转染6小时后换液与不换液的基因沉默效 率实验结果
由图3可见，荧光素酶荧光强度活性的测定取决于Luc siRNA 和Rev siRNA，其中Luc siRNA能与耙向mRNA特异性结合，而Rev siRNA作为阴性对照不能与靶向mRNA特异性结合。未加聚合物和 siRNA的细胞作为阳性对照。荧光强度的降低取决于加入了 LucsiRNA而不是阴性对照Rev siRNA，如果加入两种siRNA细胞的荧 光强度均降低了，则是由于载体的毒性而导致了细胞死亡。在不产生 细胞毒性条件下，单纯脂质体2000和PEI-25k介导的siRNA基因沉 默效率不高，最高只能分别达到14.5%和20.5%，且产生较大的细胞 毒性，只加siRNA不产生基因沉默，而PEI-PBLG介导的siRNA基 因传递最高能产生63.7%基因沉默效率，且其毒性较小。
由图4可见，转染6小时不换液后载体的毒性均略有增加，脂质 体2000和PEI-25k增加较快，PEI-PBLG基因沉默效率最高，能达到 65.2%，脂质体和PEI-25k分别为9.5Q/o和11.4%，只加siRNA没有沉 默效果。
实施例3利用两亲性高分子阳离子聚合物介导沉默荧光素酶的 Luc siRNA和阴性对照Rev siRNA对Lipofectamine2000转染荧光素 酶质粒pGL3-contro1在HeLa细胞内瞬时表达荧光素酶的体外转染实 验
(1) 用常规方法合成siRNA;
(2) 两亲性高分子阳离子聚合物/siRNA复合颗粒的制备 取所述的两亲性高分子阳离子聚合物加水溶解至浓度为
lmg/mL，用孔径为0.22jmi的微孔滤膜过滤除菌；用无菌蒸馏水配制 浓度为0.1mg/mL的siRNA水溶液，按照所述的两亲性高分子阳离子 聚合物siRNA的质量比为1.25:1、 2.5:1、 5:1、 10:1、 20:1和40:1， 将所述的两亲性高分子阳离子聚合物的水溶液和siRNA水溶液按上 述溶质质量比混合，把该混合水溶液置室温放置20分钟，进一步促进两亲性高分子阳离子聚合物与siRNA复合物颗粒的形成，得到一 种含两亲性高分子阳离子聚合物/siRNA复合物颗粒；
(3) —种两亲性高分子阳离子聚合物作为siRNA转染载体
(1) 细胞的培养
复苏Hela细胞，在含有体积分数为10%的小牛血清的高糖 DMEM细胞培养液中并在含体积百分数为5y。的(302、温度为37。C 的孵箱中连续培养；
(2) 体外转染
转染前24小时内，将HeLa细胞按^104个细胞/孔种于96孔培 养板中，置于含体积百分数为5%的C02、温度为37'C的孵箱中连 续培养至80~90%融合。转染时，吸弃前一天加注的细胞培养板中的 培养液，用PBS洗涤两次后，加入脂质体2000/pGL3-control复合颗 粒转染3h，使Hela细胞瞬时表达荧光素酶，吸掉培养板内液体后， PBS洗涤两次，再加入两亲性高分子阳离子聚合物/siRNA复合颗粒， 以及含有体积百分数为10% FBS的高糖DMEM培养液，继续培养 24小时，加入复合颗粒6h换液作为对照实验。
(3) 体外转染效率的测定
取出培养板，吸去培养液，PBS洗涤2次，加入50nL细胞裂解 液裂解，吹打均匀后取出20nL至1.5mL离心管中，然后加入lOO^L 荧光素底物，用光度计测定转染效率。
再取出20pL裂解液至新96孔板，选用美国Pierce公司BCA蛋 白检测试剂盒，加入200PL检测液，37'C孵育30分钟后，酶标仪562nm波长检测。
图5,6分别给出了两亲性高分子阳离子聚合物/siRNA复合物对 瞬时表达荧光素酶的Hda细胞转染6小时后换液与不换液的基因沉 默效率实验结果
由图5可见，荧光素酶荧光强度活性的测定取决于Luc siRNA 和Rev siRNA，其中Luc siRNA能与靶向mRNA特异性结合，而Rev siRNA作为阴性对照不能与靶向mRNA特异性结合。未加聚合物和 siRNA的细胞作为阳性对照。荧光强度的降低取决于加入了 Luc siRNA而不是阴性对照Rev siRNA，如果加入两种siRNA细胞的荧 光强度均降低了，则是由于载体的毒性而导致了细胞死亡。在不产生 细胞毒性条件下，单纯PEI-25k介导的siRNA基因沉默效率不高，只 加siRNA不产生基因沉默，脂质体2000介导siRNA效果比较明显， 但是可以看出脂质体2000细胞毒性较大，而PEI-PBLG介导的siRNA 基因传递最高能产生较高的基因沉默效率，且其毒性较小。
如图6可见，转染6小时不换液后载体的毒性均略有增加，脂质 体2000和PEI-25k增加较快，PEI-PBLG基因沉默效率最高，且产生 最小的细胞毒性，只加siRNA没有沉默效果。本发明涉及的参考文献.- M.T.McManus,P.A.Sharp,Gene silencing in mammals by small interfering RNAs,Nat.Rev,Genet 2002; 3: 737—747. J.W.Shiver,T.M.Fu,L.Chen,D.R.Casimiro,M.E.Davies，R.K.Evans，et
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权利要求
1.一种两亲性高分子阳离子聚合物的应用，其特征在于，所述的两亲性高分子阳离子聚合物用作siRNA转染载体；所述的两亲性高分子阳离子聚合物是分子量为25000的超支化聚乙烯亚胺与聚谷氨酸苄酯的共聚物超支化聚乙烯亚胺-聚谷氨酸苄酯；所述的超支化聚乙烯亚胺与聚谷氨酸苄酯的质量比为6∶4；所述的两亲性高分子阳离子聚合物的尺寸为150-250nm；所述的siRNA为沉默荧光素酶的Luc siRNA，其序列为5′-CUUACGCUGAGUACUUCGAdTdT-3′。
2. 如权利要求1所述的一种两亲性高分子阳离子聚合物作为 siRNA转染载体，其用法的步骤和条件如下(1) 用常规方法合成siRNA;(2) 两亲性高分子阳离子聚合物/siRNA复合颗粒的制备 取所述的两亲性高分子阳离子聚合物加水溶解至浓度为lmg/mL，用孔径为0.22nm的微孔滤膜过滤除菌；用无菌蒸馏水配制 浓度为O.lmg/mL的siRNA水溶液，按照所述的两亲性高分子阳离子 聚合物siRNA的质量比为1.25:1 40:1，将所述的两亲性高分子阳离 子聚合物的水溶液和siRNA水溶液按上述溶质质量比混合，把该混 合水溶液置室温放置20分钟，进一步促进两亲性高分子阳离子聚合 物与siRNA复合物颗粒的形成，得到一种含两亲性高分子阳离子聚 合物/siRNA复合物颗粒；(3) —种两亲性高分子阳离子聚合物作为siRNA转染载体(1) 细胞的培养复苏细胞，在含有体积分数为10。/。的小牛血清的DMEM细胞培 养液中并在含体积百分数为5%的C02、温度为37。C的孵箱中连续 培养；(2) 体外转染转染前24小时内，将细胞按^104个细胞/孔种于96孔细胞培养 板中，置于含体积百分数为5%的C02、温度为37'C的孵箱中连续 培养至80 90%融合；转染时，吸弃前一天加注的细胞培养板中的培 养液，用PBS洗涤两次后，加入两亲性高分子阳离子聚合物/siRNA 复合颗粒，以及含有体积百分数为10% FBS的高糖DMEM培养液， 继续培养24小时，加入复合颗粒6h换液作为对照实验；(3) 体外转染效率的测定取出培养板，吸去培养液，PBS洗涤2次，加入5(HiL细胞裂解 液裂解，吹打均匀后取出20pL至1.5mL离心管中，然后加入lOO^L 荧光素底物，用光度计测定转染效率；再取出20pL裂解液至新96孔板，选用美国Pierce公司BCA蛋 白检测试剂盒，加入200叱检测液，37"C孵育30分钟后，酶标仪562nm 波长检测。
全文摘要
本发明涉及一种两亲性高分子阳离子聚合物的应用，该聚合物用作siRNA转染载体。该聚合物是一种非病毒类基因载体。其基因沉默效率高，且细胞毒性小。对恒定表达荧光素酶的CT26细胞的最高基因沉默效率为73.4％；在转染后6h换液实验中，对恒定表达荧光素酶的4T1细胞的最高转染效率为63.7％。在瞬时转染的Hela细胞实验中，该两亲性高分子阳离子聚合物相对于商品化的PEI-25k和脂质体2000有较高的基因沉默效率和较小的细胞毒性。转染后6h不换液对照试验中，该两亲性高分子阳离子聚合物细胞毒性降低较小。
文档编号C12N15/87GK101638668SQ200910067480
公开日2010年2月3日 申请日期2009年9月2日 优先权日2009年9月2日
发明者夏加亮, 景遐斌, 琳 林, 田华雨, 郭兆培, 杰 陈, 磊 陈, 陈学思 申请人:中国科学院长春应用化学研究所