阳离子聚合物作为疫苗佐剂的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种阳离子聚合物作为疫苗佐剂的应用，属于免疫学技术领域。
【背景技术】
[0002] 据发明人所知，疫苗不仅是惠及世界范围的有效预防疾病的方法，也为某些慢性 疾病如肿瘤、追疾、乙型肝炎等提供了一种新型治疗策略。疫苗主要包括抗原（免疫原） 和佐剂。根据作用机制的不同，疫苗佐剂通常可分为两类：第一类是免疫刺激剂，直接作用 于免疫系统，通过激活免疫系统来增加和扩大对抗原免疫应答的效应，例如toll-like receptorCTLR)配体，细胞因子等；第二类是作为有效的抗原输送系统，保护抗原免受降 解，形成抗原储备库，有利于抗原的缓慢释放，并能被免疫细胞高效摄取，从而提高抗原的 特异性免疫。
[0003] 作为更安全的新型疫苗，如DNA疫苗、重组蛋白或多肤类疫苗等，由于分子量小， 免疫原性比较弱，无法引起有效的免疫应答，尤其需要佐剂来增强其免疫原性或者增强宿 主对抗原的保护性应答。
[0004] 侣佐剂包括侣盐和氨氧化侣，它是第一个被美国FDA组织批准的用于人类的佐 剂，已经广泛使用了八十多年；但它只能激发B细胞介导的体液免疫，不能引起T细胞介导 的细胞免疫，而细胞免疫对肿瘤、追疾、乙型肝炎等慢性疾病的防治尤为重要。
[0005] 现有研究表明，TLR配体作为病原相关分子模式的识别分子，能被TLR识别并结 合，将TLR配体与疫苗（抗原）组合后共同免疫，可显著提高疫苗的免疫效力，因此，TLR配 体已成为疫苗研究的候选佐剂。现有研究还表明，由TLR- 4诱导产生的IL- 12是诱导 Thl型免疫反应的主要细胞因子，细胞因子IL- 12具有免疫佐剂功能，同核酸疫苗协同使 用可明显增强体液及细胞免疫应答，但是细胞因子IL- 12生产成本较高，作为佐剂难W得 到广泛应用。此外，脂多糖是TLR- 4的经典配体，但它会引起强烈的炎症反应和严重的毒 副作用，因而不能作为一种安全有效的佐剂。
[0006] 因此开发毒性低、免疫增强效应显著、安全有效且经济实惠的佐剂对疫苗的发展 具有重要意义。
【发明内容】
[0007] 本发明所要解决的技术问题是：克服现有技术存在的问题，提供一种阳离子聚合 物作为疫苗佐剂的应用，能显著提高抗原的免疫效应。
[0008] 本发明的主要技术构思如下：发明人经调研得知，阳离子聚合物是一类由富含氨 基基团的结构单元重复聚合而成的大分子物质；运类聚合物溶于水后，氨基基团被质子化 而使聚合物带正电；由于阳离子聚合物能与带负电的核酸相互作用，因此现有技术将其广 泛用于核酸药物的传输。发明人经实践研究发现，有的阳离子聚合物具有免疫刺激效应，具 备作为疫苗佐剂的前景。发明人经进一步深入地实践研究后终于得出了相应的技术方案。 阳009] 本发明解决其技术问题的技术方案如下：
[0010] 一种阳离子聚合物作为疫苗佐剂的应用，其特征是，所述阳离子聚合物由W下方 法制得：将聚合物加入无水二甲亚讽中，加热揽拌溶解后冷却至25°C±5°C;加入N，N^-幾基二咪挫进行反应W活化聚合物的径基后，加入过量乙二胺进行反应；将反应混合物经 纯化所得乙二胺偶联聚合物即为目标产物。 W11] 本发明还提供：
[0012] 一种疫苗佐剂，其特征是，所述疫苗佐剂为阳离子聚合物；所述阳离子聚合物由W下方法制得：将聚合物加入无水二甲亚讽中，加热揽拌溶解后冷却至25°C±5°C;加入N， N^ -幾基二咪挫进行反应^活化聚合物的径基后，加入过量乙二胺进行反应；将反应混 合物经纯化所得乙二胺偶联聚合物即为目标产物。
[0013]优选地，加入无水二甲亚讽的聚合物为多糖；所述乙二胺偶联聚合物的元素分析 结果中，N元素含量为至少5 %。
[0014]更优选地，所述多糖选自葡聚糖，β-1，3-葡聚糖，琼脂糖，魔芋多糖。
[0015] 优选地，加入Ν，Ν^-幾基二咪挫后反应至少1小时；加入过量乙二胺后反应至少 12小时。
[0016]优选地，反应产物的纯化方式为先透析或层析，再经冻干后将所得目标产物保存 备用。
[0017] 本发明还提供：
[0018]一种疫苗组合物，其特征是，由抗原和上述疫苗佐剂组成。
[0019] 本发明还提供：
[0020] 一种疫苗组合物的制备方法，其特征是，包括W下步骤：将抗原、上述疫苗佐剂分 别溶解于缓冲液，将两者按预定比例混合均匀后，于4Γ+3Γ静置预定时间、使其充分复 合，即得。
[0021]优选地，所述疫苗佐剂与抗原的重量比为（0. 5-20) :1或（1-10) :1;所述预定 比例为体积比（0. 5 - 5) :1 ;所述预定时间为至少15分钟。
[0022] 优选地，所述抗原为细菌性抗原或病毒性抗原；或者，所述抗原为肿瘤抗原；或 者，所述抗原为卵清蛋白；或者，所述抗原为乙型肝炎病毒抗原、丙型肝炎病毒抗原或艾滋 病毒抗原。
[0023]发明人在实践研究中发现，属于阳离子聚合物的乙二胺偶联聚合物，尤其是乙二 胺偶联多糖，特别是乙二胺偶联的葡聚糖、β- 1，3 -葡聚糖、琼脂糖、魔芋多糖，均能有效 激活细胞免疫反应、提高抗原的免疫效应、提高抗原特异性抗体的表达，显示出佐剂效应； 通过简单混合即可与抗原复合，易操作；适用于多种给药方式（如腹腔注射、肌肉注射和皮 下注射等）。同时，乙二胺偶联聚合物的制备方法简便可控，产物性质稳定，成本低廉；乙二 胺偶联聚合物作为佐剂，生物相容性好，对抗原的免疫增强效应显著。
[0024]发明人经深入研究后认为，乙二胺偶联聚合物所带正电荷一方面能有效吸附蛋白 类或DNA类抗原，保护抗原不被降解，另一方面还能刺激抗原提呈细胞（如树突状细胞），通 过有效激活细胞免疫反应来显著增强机体对抗原的免疫应答，从而实现佐剂效应。
【附图说明】
[0025] 图1至图4分别为本发明实施例2中不同含Ν量的乙二胺偶联葡聚糖（70kDa)复 合OVA分别经腹腔注射、皮下注射、肌肉注射Ξ种给药方式对小鼠免疫后抗体滴度检测结 果图。其中，图1为腹腔注射方式免疫小鼠的抗体滴度；图2为皮下注射方式免疫小鼠的抗 体滴度；图3为肌肉注射方式免疫小鼠的抗体滴度；图4为皮下注射方式免疫小鼠IgGl与 IgG2a抗体滴度比值
[0026] 图5为本发明实施例2中不同分子量（10kDa，20kDa，40kDa，70kDa)的乙二胺偶联 葡聚糖复合OVA经皮下注射对小鼠免疫后抗体滴度检测结果图。
[0027] 图6、图7分别为本发明实施例2中乙二胺偶联葡聚糖（70kDa)经皮下注射免疫后 小鼠体重变化。其中，图6为第一次免疫后Ξ天中小鼠体重变化曲线；图7为第二次免疫后 Ξ天中小鼠体重变化曲线。
[002引图8至图10为本发明实施例3中受免疫小鼠脾细胞增殖和细胞因子表达变化示 意图。其中，图8为乙二胺偶联葡聚糖对受免疫小鼠脾细胞增殖的作用示意图；图9为OVA 体外再刺激受免疫小鼠的脾细胞分泌IFN- 丫的变化示意图；图10为OVA体外再刺激受 免疫小鼠的脾细胞分泌IL- 4的变化示意图。
[0029] 图11、图12分别为本发明实施例4中乙二胺偶联葡聚糖体外对树突状细胞和脾细 胞的刺激效应示意图。其中，图11为乙二胺偶联葡聚糖体外刺激树突状细胞分泌IL- 12 的变化示意图；图12为乙二胺偶联葡聚糖体外刺激树突状细胞分泌IFN- 丫的变化示意 图。
[0030] 图13为本发明实施例5中乙二胺偶联的β-1，3-葡聚糖，乙二胺偶联的琼脂 糖和乙二胺偶联的魔芋多糖复合OVA经皮下注射对小鼠免疫后抗体滴度检测结果图。
【具体实施方式】
[0031] 下面结合实施例对本发明作进一步详细描述。但是本发明不限于所给出的例子。 下述实施例中的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法；试剂和材料，如无特殊说明，均可 通过商业途径获得。
[0032] 实施例1制备乙二胺偶联葡聚糖
[0033] 称取500mg葡聚糖（购自BioBasicInc公司，加拿大），溶于25ml无水二甲亚讽 (购自Sigma公司，美国），加热揽拌溶解后冷却至25°C±5°C，即制得葡聚糖的二甲亚讽溶 液；加入N，N^ -幾基二咪挫佑01，购自Sigma公司，美国）揽拌反应至少1小时，^活化 葡聚糖的径基；加入2. 5ml的无水乙二胺（购自Sigma公司，美国），揽拌反应至少12小时； 将反应混合物先经透析或层析、再经冻干后将所得乙二胺偶联葡聚糖保存备用；通过元素 分析来检测乙二胺偶联葡聚糖中的含N量，含N量多少代表阳离子修饰程度高低。
[0034] 其中，选择透析时，将反应混合物转入透析袋中，W双蒸水透析3天，每天换水2 次。选择层析时，可采用凝胶柱层析。
[0035] 具体试验案例如下表所示：
[0036]
阳037] 实施例2乙二胺偶联葡聚糖复合卵清蛋白对小鼠免疫后抗体滴度检测
[0038] 1)试样及对照品与卵清蛋白的复合：
[0039] 将乙二胺偶联葡聚糖（C-Dextran，C-Dex)、未修饰的葡聚糖值extran，Dex)、 卵清蛋白（OVA,购自Sigma公司，美国）分别WPBS制成2mg/ml的溶液。然后，将乙二胺 偶联葡聚糖溶液、未修饰的葡聚糖溶液、W及作为阳性对照的佐剂如ickAntibody(QA，购 自北京博枫科生物科技有限公司）分别与卵清蛋白溶液等体积混合后，于4Γ条件下静置 15min，备用。 W40]。动物免疫：
[0041] 选用6-8周龄的巧78176雌性小鼠，每组五只，分为^下多个实验组牌5正常对 照组，单独OVA阴性对照组（即PBS+0VA阴性对照组），QA+0VA阳性对