阳离子聚合物-蛋白质纳米载体系统的制备方法和用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医学材料领域，具体涉及一种阳离子聚合物-蛋白质纳米载体系 统的制备方法和用途，特别是涉及将阳离子聚合物与蛋白质通过EDC缩合法得到阳离子聚 合物-蛋白质纳米载体系统，以及此阳离子聚合物-蛋白质纳米载体系统在荧光探针、药物 递送和基因递送方面的应用。
【背景技术】
[0002] 体内递送系统旨在提高药物的生物利用度、降低药物的毒害作用、保护药物或者 基因体内运输时的结构完整性以及活性等。生物材料是体内递送系统的关键，在此领域目 前受到广泛研究的材料主要是天然高分子或者合成高分子等。天然高分子包括壳聚糖、明 胶、纤维素等，具有良好的可降解性以及生物相容性，但对于体内组织而言，其作为异物存 在可引发各种免疫反应;合成高分子包括聚酯、聚原酸酯、聚磷酸酯等，它们在细胞水平虽 然可以实现药物的靶向递送、但是材料的体内代谢缓慢，血液半衰期短制约了其应用。本发 明立足于体内递送系统的理论和方法，进行基于阳离子聚合物和蛋白质的纳米载体体系研 究，解决纳米载体体系的生物相容性以及生物可降解性方面存在的问题，以阳离子高分子 聚合物和生物蛋白为基本原料，通过一系列化学或者物理改性的方法制备出多功能性的纳 米载体系统。
[0003] 蛋白类材料因其具有良好的生物相容性、细胞黏附性以及可降解性成为生物医学 等高新技术领域中极其具有应用潜力的一种天然高分子。阳离子聚合物基因载体主要包括 以下几类:①多肽类，如聚赖氨酸、聚谷氨酸及其衍生物;②多聚胺类，如聚乙烯亚胺、聚乙 烯亚胺树枝状分子、聚酰胺-胺型树状物等;③天然高分子，如壳聚糖、透明质酸、明胶等。
[0004] 蛋白质材料表面具有多种可反应性官能团，可以通过多种方式将聚阳离子聚合物 和蛋白质结合，使材料改性方法多样，可依据需要实现材料的多功能性，有利于达到药物的 靶向递送、降低药物体内运输的各种屏障的目的。由于蛋白子和阳离子聚合物的结构特征， 其可通过不同的作用方式如离子键、氢键、疏水作用等与药物（如紫杉醇、阿霉素、长春新 碱、顺铂、5-氟尿嘧啶、基因类等药物)相结合，实现药物的有效负载和体内递送。因而本发 明研究的纳米载体递送系统不仅丰富了体内递送体系原料的种类，提高体内递送系统的生 物相容性以及生物可降解性，而且具有广泛的应用前景。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服现有药物载体系统的不足，提供一种具有良好生物可降解 性和生物相容性的阳离子聚合物-蛋白质纳米载体系统。
[0006] 本发明的第二个目的是提供一种阳离子聚合物-蛋白质纳米载体系统的制备方 法。
[0007] 本发明的第三个目的是提供一种阳离子聚合物-蛋白质纳米载体系统在荧光探 针、药物递送和基因递送方面的用途。
[0008] 本发明的目的主要通过以下技术方案实现：
[0009] 一种阳离子聚合物-蛋白质纳米载体系统。所述的蛋白质选自等电点在酸性范围 内，具有低毒性、电正性和生物相容性的蛋白质，如:血红蛋白、珠蛋白，所述的阳离子聚合 物为聚乙烯亚胺、壳聚糖或者聚酰胺中的任意一种。其中，聚乙烯亚胺和壳聚糖优于其他阳 离子聚合物，最佳为分子量1000~2000的聚乙烯亚胺或分子量3000~20000的壳聚糖，蛋白 质和聚阳离子聚合物的质量比例为1 :〇. 2~1:20,最佳比例为1:2~1:10。
[0012] 本发明所述的阳离子聚合物-蛋白质纳米载体系统可通过疏水作用和静电作用负 载紫杉醇、阿霉素、长春新碱、甲氨蝶呤、苯丁酸氮芥、顺铂、5-氟尿嘧啶等抗肿瘤药物。
[0013] 本发明所述的阳离子聚合物-蛋白质纳米载体系统可通过静电作用负载基因类药 物，如在真核细胞中表达的质粒DNA。
[0014] -种阳离子聚合物-蛋白质纳米载体系统的制备方法，其特征是① EDC缩合:将阳 离子聚合物和蛋白质溶于PH=O.5~4的盐酸溶液中，阳离子聚合物和蛋白质的质量比为1: 1~1:10,再加入IM的盐酸溶液调节体系pH为4~6,加入1-(3-二甲氨丙基)-3-乙基碳二亚 胺盐酸盐(EDC · HCl )，搅拌，室温反应20小时，反应结束后将反应产物透析，冷冻干燥;②戊 二醛交联:将血红蛋白溶于磷酸盐缓冲溶液中，加入1~IOOmM的戊二醛溶液，室温下搅拌反 应1小时，加入1~10倍当量的聚乙烯亚胺溶液，室温下搅拌反应5小时，加入硼氢化钠溶液 终止反应，体系透析，冷冻干燥;③京尼平交联:将阳离子聚合物和血红蛋白溶于缓冲溶液 中，加入1~IOOmM的京尼平溶液，室温搅拌反应10~72小时，体系透析，冷冻干燥。
[0015] -种负载药物的阳离子聚合物-蛋白质纳米载体系统的制备方法，其特征是①水 溶性药物的负载:称取一定量的蛋白质、阳离子聚合物以及抗肿瘤药物(阿霉素、长春新碱、 顺铂或5-氟尿嘧啶)溶液pH 3~7的盐酸溶液中，加入1~IOOmM的戊二醛或京尼平溶液，室 温下搅拌反应5~72小时，体系透析;②难溶性药物的负载:移取IOmL已经制备好的阳离子 聚合物-蛋白质纳米载体，搅拌下加入紫杉醇、甲氨蝶呤、或者苯丁酸氮芥的DMSO溶液，室温 下搅拌充分吸附10~48小时，体系透析;③基因药物的负载:将质粒DNA溶于灭菌水中，获得 溶液A;将阳离子聚合物-蛋白质纳米载体用pH 7.4的磷酸缓冲溶液配制成lmg/mL的溶液， 得到溶液B; A和B按不同比例混合得到基因载体复合物。
[0016] -种阳离子聚合物-蛋白质纳米载体系统在荧光成像、药物递送和基因递送领域 的应用。
[0017] 本发明和现有技术相比具有如下突出的技术优势：
[0018] (1)本发明的阳离子聚合物-蛋白质纳米载体系统由聚阳离子聚合物和蛋白质通 过共价键合的方式制备，一方面蛋白质作为纳米载体的基质材料，有利于增加载体的生物 相容性和细胞黏附性，中和了阳离子聚合物的细胞毒性，有利于载体在细胞表面聚集，另一 方面载体表面为阳离子聚合物使载体表面呈电正性，有利于载体的细胞识别以及细胞吞 口策。
[0019] (2)本发明的阳离子聚合物-蛋白质纳米载体系统可以通过疏水作用和静电作用 负载紫杉醇、阿霉素、长春新碱、甲氨蝶呤、苯丁酸氮芥、顺铂、5-氟尿嘧啶等抗肿瘤药物，通 过静电作用负载基因药物，实现药物的有效负载和体内递送。
[0020] (3)本发明所述的京尼平交联阳离子聚合物-蛋白质纳米载体系统在550~630nm 波长范围处带有稳定且强度较高的自发荧光，可作为体内荧光探针使用。
[0021] (4)本发明所述的阳离子聚合物-蛋白质纳米载体系统原料易得，制备方式简单， 丰富了体内递送体系原料的种类，提高体内递送系统的生物相容性以及生物可降解性，具 有广泛的应用前景。
【附图说明】
[0022]图1为本发明实施例13京尼平交联阳离子聚合物-蛋白质纳米载体系统的光稳定 性。
[0023]图2为本发明实施例15Protein-PEI(l-5)阳离子聚合物-蛋白质纳米载体的体外 细胞存活率。
[0024]图3为本发明实施例16京尼平交联阳离子聚合物-蛋白质纳米载体的激光共聚焦 扫描成像。
[0025]图4为本发明实施例17阿霉素负载阳离子聚合物-蛋白质纳米载体的体外细胞存 活率。
[0026]图5为本发明实施例18BSA-PEI和CPI-PEI阳离子聚合物-蛋白质纳米载体的体外 细胞存活率。
【具体实施方式】
[0027] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面通过实施例和图表对 本发明作进一步说明，其目的仅在于更好的理解本发明的内容而非限制本发明的保护范 围：
[0028] 实施例1阳离子聚合物-蛋白质纳米载体系统的制备
[0029]将质量比为1:0.2的血红蛋白和阳离子聚合物PEI溶于pH=5的盐酸溶液中，再加 入1-(3-二甲氨丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC · HC1)溶液，搅拌，室温反应20小时，反 应结束后将反应产物透析，冷冻干燥。
[0030]实施例2阳离子聚合物-蛋白质纳米载体系统的制备
[0031]将质量比为1:5的血红蛋白和阳离子聚合物PEI溶于pH = 5的盐酸溶液中，再加入 1-(3-二甲氨丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC · HC1)溶液，搅拌，室温反应20小时，反应 结束后将反应产物透析，冷冻干燥。
[0032]实施例3阳离子聚合物-蛋白质纳米载体系统的制备
[0033] 将质量比为1:20血红蛋白和阳离子聚合物PEI溶于pH = 5的盐酸溶液中，再加入ΙΟ-二甲氨丙基 )-3-乙基碳二亚胺盐酸盐 (EDC · HC1) 溶液，搅拌，室温反应 20 小时，反应结 束后将反应产物透析，冷冻干燥。
[0034]实施例4阳离子聚合物-蛋白质纳米载体系统的制备
[0035]将质量比为1:0.2的珠蛋白和阳离子聚合物PEI溶于pH为2的盐酸溶液中，搅拌溶 解，再加入ImM的京尼平溶液，搅拌室温反应10小时，体系透析，冷冻干燥。
[0036]实施例5阳离子聚合物-蛋白质纳米载体系统的制备
[0037]将质量比为1:5的珠蛋白和阳离子聚合物PEI溶于pH为2的盐酸溶液中，搅拌溶解， 再加入20mM的京尼平溶液，搅拌室温反应48小时，体系透析，冷冻干燥。
[0038]实施例6阳离子聚合物-蛋白质纳米载体系统的制备
[0039] 将质量比为1:20的珠蛋白和阳离子聚合物roi溶于pH为2的盐酸溶液中，搅拌溶 解，再加入IOOmM的京尼平溶液，搅拌室温反应72小时，体系透析，冷冻干燥。
[0040] 实施例7阿霉素负载阳离子聚合物-蛋白质纳米载体系统的制备
[0041 ]将珠蛋白和壳聚糖溶于pH为3的盐酸溶液中，再加入一定量的阿霉素溶液，搅拌使 体系混合均匀。加入ImM的戊二醛溶液，室温搅拌反应5小时，体系透析，冷冻干燥。