一种中药组合物、其制备方法及其用途与流程

本发明涉及中药材技术领域，具体涉及一种中药组合物、其制备方法及其用途，具体而言，涉及一种从杜仲叶中提取的绿原酸有效部位，以及从栀子中提取的京尼平苷和西红花苷有效部位所制备的组合物，及其组合物在制备减肥药，以及减肥保健食品中的应用。

背景技术：

杜仲叶为杜仲科植物杜仲eucommiaulmoidesoliv的干燥叶。研究发现杜仲叶水提物可减肥调脂，降低动物体重，抑制甘油三酯在脂肪细胞积聚；对高脂小鼠血清胆固醇(tc)和甘油三酯(tg)降低作用明显，且升高血清高密度脂蛋白胆固醇(hdl-c)；对喂食高脂饮食仓鼠具有降低血浆tg、游离脂肪酸(ffa)、tc、低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)和肝脏胆固醇的水平，升高血浆hdl-c与tc的比值，以及载脂蛋白-a1(apo-a1)的水平，主要是通过改变肝脏中的脂肪生成、脂肪酸β氧化水平及胆固醇代谢来实现的。杜仲叶乙醇提取物具有降低血脂含量与调节机体血脂代谢的作用，杜仲叶甲醇提取物具有抗肥胖的作用，如降低体重、白色脂肪组织重量、血浆tg和tc的水平。

栀子，学名：gardeniajasminoidesellis，别名：黄栀子、山栀、白蟾，是茜草科植物栀子的果实。栀子的果实是传统中药，属卫生部颁布的第1批药食两用资源，具有护肝、利胆、降压、镇静、止血、消肿等作用。在中医临床常用于治疗黄疸型肝炎、高血压、糖尿病等症。栀子有效组分主要为西红花苷和京尼平苷等。药理研究表明，栀子可产生抗氧化、抑制血小板聚集，调节血脂水平防止动脉粥样硬化及减肥等功效。提示栀子有效成分在减肥调脂方面具有较高的研究开发价值。

肥胖症是一组常见的代谢症群。当人体进食热量多于消耗热量时，多余热量以脂肪形式储存于体内，其量超过正常生理需要量，且达一定值时遂演变为肥胖症。诱使肥胖的外因以饮食过多而活动过少为主，内因为脂肪代谢紊乱。肥胖症的发病机理复杂，包括遗传因素、神经精神因素、内分泌因素、褐色脂肪组织异常等。目前批准上市的减肥药主要以化学类为主，虽然安全性较高，但在复杂的中枢神经系统中，对类似的受体都有一定的作用，从而引起不可避免的相应副作用。

虽然现有技术披露有关于绿原酸和京尼平苷减肥作用的研究，但是，没有揭示杜仲叶提取物与栀子提取物联用对减肥的作用。且由于中药成分复杂，想以传统中药来达到理想的减肥效果，仍是技术研发人员需要解决的课题。

技术实现要素：

鉴于现有技术没有披露杜仲提取物与栀子提取物组合制备减肥药的问题，提供一种从杜仲叶中提取的绿原酸有效部位，以及从栀子中提取的京尼平苷和西红花苷有效部位所制备的组合物。

本发明提供一种中药组合物，包括杜仲叶提取物和栀子提取物，其中杜仲叶提取物的重量是栀子提取物重量的1/4～4倍。

进一步的，所述杜仲叶提取物和栀子提取物的重量比为1。

作为优选的，所述杜仲叶提取物包括绿原酸，所述栀子提取物包括京尼平苷和西红花苷。

本发明的工作原理及有益效果，本发明选用我国药食两用的传统中药材杜仲叶和栀子为研究对象，将杜仲叶提取物和栀子提取物按照一定比例混合，使组合物中含有绿原酸、京尼平苷和西红花苷的有效部位。制备的中药组合物中的有效成分相互协同，相互促进，具有明显的抗炎、调脂减肥作用，同时能激活胆汁酸相关转运体蛋白的表达，且组方效果优于其中的单一提取物，并且无明显的毒副反应和药物耐受性。

一种中药组合物的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、备料：分别称取杜仲叶和栀子，分别干燥粉碎，得到杜仲叶粉末和栀子粉末；

步骤二、浸提：采用重量比为杜仲叶粉末8～10倍的60％乙醇对杜仲叶粉末浸提2～4次，每次6-10小时后过滤得到杜仲叶浸提液，采用重量比为栀子粉末8～10倍的60％乙醇对栀子粉末浸提2～4次，每次6～10小时后过滤得到栀子浸提液；

步骤三、纯化：分别将杜仲叶浸提液和栀子浸提液旋转蒸发浓缩，用大孔树脂分别对杜仲叶浸提液和栀子浸提液分离纯化，得到杜仲叶纯化液和栀子纯化液；

步骤四、洗脱：采用5％-60％的乙醇溶液对杜仲叶纯化液和栀子纯化液分别进行梯度洗脱，将栀子中主要含京尼平苷及西红花苷的两部分的洗脱液进行合并得到栀子洗脱液，将杜仲叶中绿原酸部分进行收集合并得到杜仲叶洗脱液；

步骤五、浓缩干燥：对杜仲叶洗脱液和栀子洗脱液分别减压浓缩至浸膏，分别冷冻干燥得到杜仲叶提取物和栀子提取物；

步骤六、混合：将杜仲叶提取物和栀子提取物按照上述比例混合得到中药组合物。

进一步的，所述步骤二中，浸提的次数为3次。浸提3次成分含量最高，3次以后浸提液色明显变浅，点板薄层层析目标产物色浅。

进一步的，所述步骤二中，浸提的时间为8小时。8小时的浸提时间为最佳时间，浸提8小时有效成分能够充分出来，且能够较好的控制酒精浓度，若时间太长则酒精挥发不利于提取。

本发明的制备方法的优点：本实验对杜仲叶及栀子通过60％乙醇溶液冷浸进行充分提取，粗提液中主要活性成分提取率较高且杂质少易处理。使用大孔树脂对提取液进行分离纯化，不同浓度乙醇溶液进行梯度洗脱分离，薄层色谱检识分离度及纯度发现两种型号树脂对各自药材中不同组分吸附能力强、分离度高、易解吸，能得到纯度较高的提取物；采用uplc(超高效液相色谱)及uv(紫外线滤光镜)分别对分离纯化样品进行含量测定，精确测定各自含量：ge含52.5％京尼平苷、10.5％西红花苷总苷；ee绿原酸含量为52.3％。采用hplc-ms/ms质谱联用技术建立的杜仲叶及栀子提取物测定方法，初步判断杜仲叶提取物中主要成分为绿原酸、芦丁、金丝桃苷，栀子提取物中主要成分为京尼平苷、西红花苷-1、西红花苷-2、京尼平龙胆二糖苷。此方法能高效、准确、全面地评价其化学成分，在杜仲叶及栀子相关研究及质量控制方面是一个可行的方法。

进一步的，所述的组合物在制备减肥药物或者制备减肥食品中的用途。

一种非治疗目的减肥方法，包括口服中药组合物。

附图说明

图1为本发明的中药组合物对小鼠血清中血清胆固醇tg含量影响的曲线图；

图2为本发明的中药组合物对小鼠血清中甘油三酯tc含量影响的曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方法进行详细介绍：

栀子提取物分离

(1)浸提部分：

取风干后的栀子样品粉碎，以10倍质量55％的乙醇溶液冷浸提取3次，每次8h，过滤，合并提取液，减压抽滤去除杂质后，保留上清液体，旋转蒸发浓缩后，即得上样液。

(2)大孔吸附树脂分离：

1)预处理：因大孔吸附树脂在生产过程中会混杂入未形成聚合物的单体、分散剂、致孔剂、惰性溶剂，故需对树脂进行预处理。hpd100大孔吸附树脂经乙醇浸泡24h，后经乙醇洗至流出液不浑浊，再用蒸馏水洗脱除去杂质直至流出液无醇味，用5％盐酸溶液通过树脂柱，浸泡2-4h，再用水洗至中性，备用。

2)装样：将样品溶于纯净水中，制得上样液，以一定的流速缓慢加注到柱的上端开始吸附。

3)洗脱：先用水清洗以除去树脂表面或内部残留的非极性或水溶性大的强极性杂质(如多糖及无机盐)，后以10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、95％的乙醇由低至高浓度以一定的流速进行洗脱，根据流出液颜色及吸附树脂颜色变化，适时调整洗脱速度。

4)薄层色谱分析：将硅胶薄层板置于105℃的烘箱中活化半小时，取出置于硅胶板架中待用。在摸索栀子薄层色谱的展开剂中，尝试了不同的溶剂体系：石油醚-乙酸乙酯，甲醇-水等，并尝试了不同类型的硅胶板，得出硅胶gf254板可实现目标化合物的清晰分离。实践证明展开剂乙酸乙酯：甲醇：水＝100:20:13可以使目标化合物基本实现在硅胶板上的有效分离。栀子提取液洗脱过程中以京尼平苷、西红花苷为对照品进行薄层分析：将硅胶板上的展开剂展开至距底部12cm时取出自然晾干后，喷20％硫酸-乙醇溶液作为显色剂，置于105℃烘箱烘烤10min，观察薄层板位点并计算rf值。rf＝展开斑点中心至点样点中心距离/溶剂前沿至点样点距离。

5)洗脱液筛选及合并：栀子提取物洗脱液过程中以京尼平苷、西红花苷为对照品进行薄层分析，并以此为依据全程监测大孔树脂洗脱液的成分及含量，将栀子洗脱液中主要含京尼平苷和西红花苷的两部分洗脱液分类合并，减压浓缩至浸膏，经冷冻干燥后分别得到栀子提取物干粉a(西红花苷总苷)、栀子提取物干粉b(京尼平苷)，混合得到栀子提取物(西红花苷总苷、京尼平苷)。

杜仲叶提取物分离

方法同栀子的提取步骤一致，得到杜仲叶提取物(绿原酸)。

薄层色谱检测、合并及定性检测：同一薄板上，取各部分洗脱液，与绿原酸标准品对照，以石油醚-乙醇(1:3,v/v)作为展开剂，室温展开，干燥后，紫外灯鉴识，5％硫酸-乙醇溶液显色，烘烤10min。薄层色谱结果只有一个明显斑点，rf相同部分，即判断为绿原酸洗脱物。合并与标准品rf相同部分，以此真空旋转蒸发至干燥，得杜仲叶提取物干粉。

uplc对提取物的定量分析

色谱条件的选择

1)绿原酸含量测定的uplc色谱条件：behshieldrpc18(1.7μm，2.1μm×50mm)色谱柱；流速0.3ml/min；柱温30℃；流动相：v乙腈：v0.4％磷酸溶液＝13:87；检测波长327nm；进样量2μl。

2)京尼平苷含量测定的uplc色谱条件:behshieldrpc18(1.7μm，2.1μm×50mm)色谱柱；流速0.3ml/min；柱温30℃；流动相：v甲醇：v水＝30:70；检测波长238nm；进样量2μl。

西红花苷总苷含量选择紫外可见分光光度计在最大吸收峰440nm进行测定。

京尼平苷、绿原酸、西红花苷对照品的配制：

精密称取京尼平苷、绿原酸、西红花苷-1标准品适量，加50％甲醇分别配制成100μg/ml的京尼平苷、绿原酸和西红花苷-1对照品母液。

分别检测仪器及样品的精密性、稳定性、回收率、重复性。

标准曲线的建立及样品含量的测定：

1)京尼平苷、绿原酸的标准曲线：分别吸取0.5ml、1ml、2ml、4ml、8ml的京尼平苷或绿原酸母液，置10ml量瓶中加50％甲醇稀释至刻度超声混匀，0.22μm微孔滤膜过滤后，精确吸取2μl注入uplc，每个浓度进样5次，分别以京尼平苷、绿原酸浓度(μg/ml)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

2)西红花苷的标准曲线：分别取0.5ml、1ml、2ml、4ml、8ml西红花苷母液置10ml量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度超声混匀，吸取2ml于石英比色杯中440nm下测定，每个浓度测定5次，以西红花苷浓度(μg/ml)为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

3)提取物溶液的配制及含量测定：精密称取杜仲叶提取物或栀子提取物适量，均配制成20μg/ml，使用uplc法分别测定杜仲叶提取物中绿原酸的含量、栀子提取物中京尼平苷的含量；同法配制80μg/ml的栀子提取物使用uv法测定栀子提取物中西红花苷的含量。并分别根据各自对照品标准曲线计算含量。

杜仲叶提取物中绿原酸含量约为52.5％，栀子提取物中京尼平苷含量约为52.8％，西红花总苷含量约为10.8％。

lc-ms对提取物成分的定性分析

杜仲叶提取物lc-ms分析条件的选择：

色谱条件：extend-c18色谱柱(2.1mm×50mm，1.8μm)；流动相：0.1％甲酸(a)一乙腈(b)(其中梯度洗脱程序为：0.01min：a—b(90：10)；3min：a—b(60∶40)；7min：a—b(30：70)；9min：a—b(10：90)；11min：a—b(90：10)；记录时间：13min)；流速：0.3ml/min；柱温：30℃；检测波长：327nm；进样量：2μl。

质谱条件：esi(一)；干燥气流速：12l/min；雾化室压：20psi；毛细管电压：4500ev；加热毛细管温度350℃；扫描范围：50～1000m/z；吹扫气压力275.6kp。

栀子提取物lc-ms分析条件的选择：

色谱条件：extend-c18色谱柱(2.1mm×50mm，1.8μm)；流动相：水(a)一甲醇(b)(其中梯度洗脱程序为0.01min：a—b(70：30)；4min：a—b(40：60)；8min：a—b(20：80)；10min：a—b(70：30)；记录时间：12min)；流速：0.3ml/min；柱温：30℃；二极管阵列检测器记录190～700nm紫外-可见光谱，检测波长设定为440nm及238nm；进样量：2μl。

质谱条件：esi(+)；干燥气流速：12l/rain；雾化室压：20psi；毛细管电压：4500ev；加热毛细管温度350℃；扫描范围：50～1000m/z；吹扫气压力275.6kp。

二种提取物主要成分的结果分析：

在lc-ms对供试品溶液进行全扫描获得一级质谱的基础上，利用离子阱质谱的步进式碰撞功能，通过改变电场梯度和能量梯度，获得了总离子流图中的各个主峰的分子离子流图及质谱图，结合相关文献资料对总离子流图中较大离子流峰进行归属，定性分析提取物中未明确化合物。

实施例1：

试验方法

皮下注射谷氨酸钠(4g/kg/d)干预乳鼠生长，正常对照组皮下注射相应剂量的生理盐水(10μl/g/d)，4周后将实验小鼠分为9组：正常对照组(normal)、模型组(model)、阳性对照药白藜芦醇组(res)、杜仲叶提取物高剂量组(eeh：400mg/kg)、杜仲叶低剂量组(eel：100mg/kg)、栀子提取物高剂量组(geh：400mg/kg)、栀子提取物低剂量组(gel：100mg/kg)、联用高剂量组(eeh+geh：400mg/kg+400mg/kg)、联用低剂量组(eel+gel：100mg/kg+100mg/kg)，每组10只小鼠。

灌胃期间正常组给予普通饲料，其余各实验组给予高脂饲料，灌胃给药8周后，测定各组小鼠体重和附睾脂肪湿重，试剂盒测定血清中甘油三酯(tg)和胆固醇(tc)水平，elisa法测定血清中肿瘤坏死因子α(tnf-α)、白介素–6(il-6)、一氧化氮合酶(inos)含量。westernblot法检测各组小鼠肝脏和回肠中胆汁酸相关转运体atp结合转运蛋白g5/8(abcg5/8)、胆汁酸转运体胆汁酸输出泵(bsep)、法尼醇x受体(fxr)、牛磺胆酸共运蛋白(ntcp)、小异二聚体伴侣(shp)、g-蛋白偶联受体(tgr5)蛋白含量的变化，内参基因为gapdh。

测定结果如下表1～表3所示：

上述数据结果表明，杜仲叶提取物和栀子提取物可有效降低谷氨酸钠诱导的高脂饮食肥胖小鼠的体重，降低血清的的甘油三酯(tg)和胆固醇(tc)水平，降低血清中的肿瘤坏死因子α(tnf-α)、白介素–6(il-6)、一氧化氮合酶(inos)含量。激活肝脏和回肠中胆汁酸相关转运体的蛋白表达，降低胆汁酸抑制基因的蛋白表达水平。

如图1、图2所示，a表示与空白组相比，p<0.05；b表示与模型组相比，各给药组p<0.05，c表示与杜仲高剂量相比p<0.05，d表示与杜仲低剂量相比p<0.05，e表示与栀子高剂量相比p<0.05，f表示与栀子低剂量组相比p<0.05。与normal组相比，model组小鼠血清中的甘油三酯(tg)、总胆固醇(tc)显著升高，差异具有统计学意义(p<0.05)；与model组比较，各给药组均能不同程度降低tg、tc。其中eeh+geh组降低tg和tc的作用最强。

实用性

根据本发明实施例所提供的组合物可应用于中药领域或是保健食品领域，尤其适用于肥胖人群，能够有效减轻肥胖人群的体重，达到减肥的效果。对本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利。

急性毒性试验

以小鼠为试验动物，对栀子提取物(主要成分京尼平苷和西红花苷，ge)，杜仲叶提取物(主要成分绿原酸,ee)进行急性毒性研究，测定其半数致死量。方法：采用60％乙醇提取杜仲叶，栀子，经大孔吸附树脂分离后得到提取物为试药，经口给小鼠进行灌胃，观察不同剂量下小鼠的死亡情况及毒性情况，观察病理切片he染色结果。结果：栀子提取物的ld50大于5000mg/kg；杜仲叶提取物的ld50为大于5000mg/kg；两者混合物的ld50为大于5000mg/kg。显示当用量为5000mg/kg时，心脏显示充血，心肌纤维断裂，再加大剂量可能导致心力衰竭；脾脏显示淋巴小结界限模糊不清，大量炎症因子聚集；肺显示充血，炎症因子聚集；肾显示肾小球囊腔大小不等，肾小球扩张充血，肾小球内炎症聚集；肝脏表现为中央静脉红细胞聚集增多，肝索排列不整齐，炎症细胞聚集。结论：根据急性毒性试验分级，显示当栀子提取物，杜仲叶提取物及其混合物在5000mg/kg以下时，为低毒性，为其用药提供依据。