一种基于siRNA的双偶联复合物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种基于SiRNA的双偶联复合物。
【背景技术】
[0002] RNAi疗法能够使得特定的信使RNA(mRNA)沉默，防止产生造成疾病的蛋白质，从 而针对疾病根源。RNAi疗法也可能以根本的新方式，治疗疾病和帮助患者。
[0003] 近年来，基于小分子干扰RNA(SiRNA)技术的基因治疗方法取得了成功。由于 SiRNA可直接在胞浆内进行表达，具有起效快速且给药的时间间隔灵活可控的优点。因此， 通过SiRNA输送进行基因治疗的相关生物医学技术得到了迅速的发展，这种技术可单独使 用以治疗病毒感染性疾病及肿瘤等。
[0004] 目前作为SiRNA基因输送的载体大多为合成阳离子分子、高分子，其实现基因负 载与输送的原理为利用载体阳离子功能分子、高分子中的正电荷（+)与SiRNA基因序列中 磷酸基团所携带的负电荷（_)的静电相互作用，结合组装形成稳定的复合物，保护所负载 的SiRNA，同时可提高其在体内的稳定性，从而提高SiRNA输送的效率。
[0005] 然而，到目前为止，虽然国内外已经开发报道了多种阳离子功能分子如阳离子聚 合物、阳离子脂质体等，并作为载体应用于体外或体内细胞/组织水平的siRNA输送，但在 实际应用中，大多数脂质阳离子功能分子在血液循环中不稳定，容易被网状内皮系统吞噬 后清除而导致其失活。且许多阳离子载体具有免疫原性，可刺激、诱导细胞的免疫应激反 应，进而导致毒副作用。
【发明内容】
[0006] 基于此，有必要提供一种可改善合成基因载体的生物相容性、减低毒性且能增强 siRNA转染效果的新型生物功能材料。
[0007] -种基于siRNA的双偶联复合物，包括棕榈酸、叶酸，及同时偶联棕榈酸和叶酸 的siRNA，双偶联复合物的结构式为：
[0009] 其中，siRNA的正义链与棕榈酸偶联时，siRNA的反义链与叶酸偶联；siRNA的反义 链与棕榈酸偶联时，siRNA的正义链与叶酸偶联。
[0010] 在其中一个实施例中，叶酸与siRNA之间偶联的连接体为聚乙二醇，双偶联复合 物的结构式为：
[0012] 其中6彡n彡18。
[0013] 在其中一个实施例中，n= 12,双偶联复合物的结构式为：
[0015] 这种基于siRNA的双偶联复合物，棕榈酸能结合白蛋白，减少肾脏的滤过，白蛋白 能增加所携带的siRNA进入癌细胞，另外，脂溶性棕榈酸能帮助水溶性核酸进入细胞内。而 叶酸具有肿瘤靶向的功能，能结合肿瘤表面的叶酸受体，诱导siRNA复合物进入肿瘤细胞， 从而抑制致癌基因的表达。
[0016] 因此，这种基于siRNA的双偶联复合物通过化学修饰核酸，改善了siRNA的生物相 容性及毒性，且增强了siRNA的转染效果，此外这种复合物分子小，易于进入肿瘤细胞，且 成分明确，易于大规模制备。
【附图说明】
[0017] 图1为本发明一对比实验的细胞特异性荧光强度的平均值的柱状对比图；
[0018] 图2为本发明一对比实验的裸鼠体内肿瘤摄取情况的全身摄影对比图；
[0019] 图3为本发明一对比实验的siRNA在肿瘤组织中浓度随时间变化的折线图；
[0020] 图4为本发明一对比实验的siRNA在排泄倒尿液中浓度随时间变化的折线图；
[0021] 图5为本发明一对比实验的siRNA在不同器官中含量的体外摄影对比图；
[0022] 图6为本发明一对比实验的肿瘤组织对siRNA摄取24h后的体内与体外摄影对比 图。
【具体实施方式】
[0023] 为了便于理解本发明，下面将用具体实施例对本发明进行更全面的描述。但是，本 发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这实施例 的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
[0024] -种基于siRNA的双偶联复合物，包括棕榈酸、叶酸，及同时偶联棕榈酸和叶酸的 SiRNA0
[0025] 棕榈酸与叶酸分别与siRNA的双链偶联。即当siRNA的正义链与棕榈酸偶联时， siRNA的反义链与叶酸偶联；当siRNA的反义链与棕榈酸偶联时，siRNA的正义链与叶酸偶 联。
[0026] 棕榈酸在合成RNA时加在3'端。叶酸与siRNA之间偶联的连接体为聚乙二醇， siRNA上的炔烃与叶酸链接的聚乙二醇叠氮化物形成稳定的三氮唑键。
[0028] 这种基于siRNA的双偶联复合物，棕榈酸能结合白蛋白，减少肾脏的滤过，白蛋白 能增加所携带的siRNA进入癌细胞。
[0029] 叶酸具有肿瘤靶向的功能，能结合肿瘤表面的叶酸受体，诱导siRNA复合物进入 肿瘤细胞，从而抑制致癌基因的表达。
[0030] 以下结合具体实施例对上述基于SiRNA的双偶联复合物进行详细说明。
[0031] 实施例1，一种基于siRNA的双偶联复合物，包括棕榈酸、叶酸，及同时偶联棕榈酸 和叶酸的siRNA。叶酸与siRNA之间偶联的连接体是长度为6的聚乙二醇。实施例1的双 偶联复合物的结构如下：
[0033] 实施例2, 一种基于siRNA的双偶联复合物，包括棕榈酸、叶酸，及同时偶联棕榈酸 和叶酸的siRNA。叶酸与siRNA之间偶联的连接体是长度为12的聚乙二醇。实施例2的双 偶联复合物的结构如下：
[0035] 实施例3, 一种基于siRNA的双偶联复合物，包括棕榈酸、叶酸，及同时偶联棕榈酸 和叶酸的siRNA。叶酸与siRNA之间偶联的连接体是长度为18的聚乙二醇。实施例3的双 偶联复合物的结构如下：
[0036]
[0037] 对比实验I :对比不同长度的聚乙二醇连接体对保持叶酸的细胞结合功能的影 响。结合图1，通过血清培养基，在37°C环境下，分别让实施例1、实施例2、实施例3的siRNA 摄入KB细胞株，放置4小时后，通过用流式细胞仪测量各实施例中的细胞特异性荧光强度 的平均值，比较siRNA的细胞结合以及摄入效果。
[0038] 通过对比实验1，可见长度为12的聚乙二醇作为连接体，对保持叶酸的细胞结合 功能最强。
[0039] 对比例1 :在未经化学修饰的siRNA上标记