用于构建放射性同位素偶联标记的ADC药物的改造抗体IgG1-CH-K330C的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种用于构建放射性同位素偶联标记的ADC 药物的改造抗体IgGl-CH-K330C。
【背景技术】
[0002] 现代生物学证明癌症有很强的多样性，并且选择性不好的药物会对正常细胞产生 很大的负作用。目前癌症新药研发局面缓慢，仍然有大量的癌症没有比较好的治疗办法。肝 癌、肺癌、胰腺癌的五年存活率都在15%以下。当前癌症新药研发的平台大致分为单克隆抗 体大分子生物药和小分子化学药，小分子化学药选择性差，会对正常细胞产生难以预期的 毒性。单克隆抗体，简称单抗，对某一类细胞的选择性高，并可以在体内自然代谢，所以安全 性相对较高，但单克隆抗体通常只能作用于细胞表面的靶点，因而经常只能起到抑制作用 而并不能真正杀死癌细胞。
[0003] 理想的药物就是把优异临床疗效的靶向特异性抗体和小分子药物药代动力学结 合起来，这就是抗体一药物偶联物ADC。抗体-药物偶联物ADC是把具有细胞内吞作用的靶 向特异性抗体和具有特定药理学特性，如细胞强毒作用的小分子化合物结合起来。即利用 单克隆抗体把具有强烈毒副作用的毒素小分子化药靶向到肿瘤细胞，以期达到提高疗效， 减少毒副作用。这项技术既克服了单抗药靶点可选性少，杀伤力差等缺点；同时又解决了小 分子毒性高，代谢不稳定的问题。抗体-药物偶联物ADC因在血液中相对稳定，能有效地降 低小分子细胞毒素化药本身对循环系统以及健康组织的毒性，是目前抗肿瘤领域的研宄热 点之一 〇
[0004] 抗体-药物偶联物ADC在抗癌领域拥有广泛的发展空间，成为近年来抗肿瘤药 物领域中最受关注的靶向药物，成功应用于临床的例子有治疗乳癌的曲妥珠单抗，治疗非 霍奇金淋巴瘤的利妥昔单抗等。抗体一药物偶联物ADC药物的抗体部分为单链抗体，效应 分子通常由放射性核素、药物或毒素片段等组成，以抗体为载体的免疫偶联物将效应分子 带到肿瘤区域的靶细胞，进而以效应分子对靶细胞的选择性杀伤作用来治疗癌症，因而抗 体-药物偶联物ADC药物被称为治疗恶性肿瘤的"生物导弹"。抗体一药物偶联物ADC药物 中单克隆抗体部分的靶向作用和抗体所连接的效应分子对靶细胞的杀伤作用两者都是至 关重要的。
[0005] 在单抗新药的研发和改造中，分子影像学成为当今及其重要的研宄手段，正电子 发射断层显像immunopositron emission tomography，以下简称ImmunoPET。为近年来发 展的新兴分子影像学技术，借助于其PET的高灵敏性和抗体高特意性的结合，可用于寻找 和量化单抗，从而提供了一种量化分子靶标的方法，成为在疾病诊断中广泛使用的发展设 计技术。
[0006] 当前，抗体-药物偶联物ADC研发比较领先的公司主要有ImmunoGen和Seattle Genetics。ImmunoGen的主要技术是依靠抗体表面的Lysine将活性小分子和抗体连接起来 制成ADC。这个技术的最大问题在于抗体表面有大量可以连接小分子的赖氨酸，这样就使得 每次产生的ADC上一个抗体连接的活性小分子数量不能保持稳定。有的抗体搭载多达8个 小分子，有的却很少，甚至没有。过多承载小分子的抗体会失去抗体本身的特性，而搭载不 足的抗体又不能在癌细胞内部产生足够的致死浓度。Seattle Genetics的主要技术是依靠 还原抗体配对的S-S键，然后依靠还原后的SH基团与连接物上的还原态的硫形成新的S-S 键，从而将活性小分子和抗体连接起来制成ADC。他们的技术问题在于破坏了抗体原有的配 对S-S键，使得抗体的稳定性大大降低，而且每次还原的抗体配对的S-S键数量不恒定，使 得他们和ImmunoGen有同样的问题，每次产生的抗体-药物偶联物ADC上一个抗体连接的 活性小分子数量不能保持一致。ADC药物中单克隆抗体部分的靶向作用和抗体所连接的效 应分子对靶细胞的杀伤作用两者都是至关重要的。
[0007] 目前缺乏一种在不影响抗体靶向性和功能性的前提下，突变改造的突变点不影响 抗体可变区与抗原结合的活性；维持可结晶片段区的构象和功能；点突变位于抗体分子表 面；突变在温和条件下即可连接链接物的抗体。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是在不影响抗体靶向性和功能性的前提下，通过对抗体表面进行定 点突变，从而控制连接活性小分子，突变在温和条件下即可连接连接物的用于构建放射性 同位素偶联标记的ADC药物的改造抗体IgGl-CH-K330C。
[0009] 为了实现上述技术目的，本发明提供的技术方案为：一种用于构建放射性同位素 偶联标记的ADC药物的改造抗体IgGl-CH-K330C，包括
[0010] (a)重链恒定区，包括重链恒定区CH1的氨基酸序列、重链恒定区CH2的氨基酸序 列和通过突变改造过得到的重链恒定区CH3的氨基酸序列；所述重链恒定区CH1的氨基酸 序列是SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，所述重链恒定区CH2的氨基酸序列是SEQ ID NO: 10 所示的氨基酸序列，所述重链恒定区CH3的氨基酸序列是SEQ ID NO: 12所示的氨基酸序 列；
[0011] (b)重链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列是SEQ ID NO:2所示的氨基酸序 列；
[0012] (C)轻链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列是SEQ ID N0:4所示的氨基酸序 列；
[0013] (d)轻链恒定区，所述轻链恒定区的氨基酸序列是SEQ ID N0:6所示的氨基酸序 列。
[0014] 进一步地，制备所述的用于构建放射性同位素偶联标记的ADC药物的改造抗体 IgGl-CH-K330C的方法。
[0015] 进一步地，用于构建放射性同位素偶联标记的ADC药物的改造抗体 IgGl-CH-K330C的搭载小分子、毒素或核素的方法。
[0016] 更进一步地，本发明的一种分离的核酸，包括所述的重链恒定区的核苷酸序列、重 链可变区的核苷酸序列、轻链恒定区的核苷酸序列和轻链可变区的核苷酸序列；
[0017] 所述重链恒定区的核苷酸序列包括所述重链恒定区CH1的核苷酸序列、重链恒定 区CH2的核苷酸序列和重链恒定区CH3的核苷酸序列；
[0018] 所述重链恒定区CH1的核苷酸序列是SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列，所述重链 恒定区CH2的核苷酸序列是SEQ ID N0:9所示的核苷酸序列，所述重链恒定区CH3的核苷 酸序列是SEQ ID NO: 11所示的核苷酸序列；
[0019] 所述重链可变区的核苷酸序列是SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列，所述轻链恒定 区的核苷酸序列是SEQ ID N0:5所示的核苷酸序列，所述轻链可变区的核苷酸序列是SEQ ID N0:3所示的核苷酸序列。
[0020] 进一步地，上述改造抗体IgGl-CH-K330C用于治疗和诊断工具以检测表达腱生蛋 白的疾病的用途。
[0021] 进一步地，所述疾病为恶性肿瘤或系统性自身免疫病或新生血管类疾病。
[0022] 更进一步地，所述恶性肿瘤选自囊性脑肿瘤、神经胶质瘤、鼻咽癌、胰腺癌、肺癌、 食管癌、乳腺癌、胃癌、大肠癌、肝癌、前列腺癌、卵巢恶性肿瘤、宫颈癌、子宫内膜癌、恶性黑 色素瘤、皮肤癌、淋巴瘤、白血病或甲状腺癌。
[0023] 进一步地，所述系统性自身免疫病选自系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、系统性 脉管炎、硬皮病、天疱疮、皮肌炎、混合结缔组织病、自身免疫性溶血性贫血、甲状腺自身免 疫病或溃疡性结肠炎。
[0024] 更进一步地，所述新生血管类疾病选自黄斑水肿、脉络膜新生血管性疾病、新生血 管青光眼、视网膜静脉阻塞或视网膜新生血管性疾病。
[0025] 有益效果：本发明在单抗体表面进行定点突变。选用IgGl的骨架，在可结晶片段 Fc端进行半胱氨酸Cys突变，通过可结晶片段Fc端的突变点进行定向的化学偶联形成特定 的抗体偶联物。本发明具有如下优点：
[0026] (1)本发明在不影响抗体靶向性和功能性的前提下，通过对抗体表面进行定点突 变，从而解决控制连接活性小分子的数目这个问题。通过控制突变基团的数目来控制连接 活性小分子的数目，从而克服抗体-药物偶联物ADC上一个抗体连接的活性小分子数量不 能保持一致的关键性技术障碍。
[0027] (2)经过半胱氨酸Cys替换改造的抗体骨架，除去重链可变区和轻链可变区的 IgGl人抗体部分，维持了正常的抗体空间构象和可结晶片段Fc功能，用基因工程的方法构 建不同的抗体以达到多种靶向和结合多种抗原的功能。
[0028] (3)经过突变的单抗体既保持了抗体的选择性和稳定性，又能搭载稳定数量的小 分子、毒素或核素。通过替换新增半胱氨酸Cys位点的巯基与恰当的连接物结合后，可以与 小分子毒素、化疗药物、放射性同位素、亲和配体连接，连接复合物应用于多种类型的抗肿 瘤治疗和体外体内病理诊断等各个方面。
[0029] 说明书附图
[0030] 图1为Herceptin单克隆抗体的重链可变区DNA序列PCR产物琼脂糖凝胶电泳 图；
[0031] 图2为Herceptin单克隆抗体的轻链可变区DNA序列PCR产物琼脂糖凝胶电泳 图；
[0032] 图3为重链可变区和轻链可变区克隆结果PCR鉴定图；
[0033] 图4为轻链可变区质粒抽提电泳图；
[0034] 图5为重链可变区质粒抽提电泳图；
[0035] 图6为Here印tin重链恒定区330位点突变后电泳图；
[0036] 图7为Here印tin重链恒定区330位点突变后质粒抽提电泳图；
[0037] 图8为重链恒定区330位点突变后表达的蛋白SDS-PAGE图；
[0038] 图9为抗体结构