抗hsv抗体的制作方法
【专利说明】抗HSV抗体
[0001] 本申请是中国专利申请号201080052679. 9的分案申请。
[0002] 发明背景
[0003] 本发明涉及如权利要求中定义的抗HSV抗体，包含有效量的所述抗体的药物组合 物，包含编码所述抗体的核苷酸序列的表达载体，包含所述核苷酸序列的宿主细胞，能够产 生所述抗体的杂交瘤细胞和所述抗体作为药物的用途，特别涉及用于制备用于预防性或治 疗性处理受试者中的HSV相关疾病的药物的用途；如权利要求中所定义。
[0004] 人致病性单纯疱瘆病毒（HSV)是嗜皮肤的和嗜神经的DNA病毒，其临床表现主要 起源于皮肤和附近的粘膜，继发性导致神经并发症，例如神经炎、脑膜炎、脑炎、脊髓炎、多 神经根炎等等。在先天性、获得性和医原性的免疫缺陷的情况下，报告了一定程度上的严重 进展，具有高致死性。由于具有1型批￥(批￥-1，95%;唇疱瘆，角膜疱瘆，疱瘆性湿瘆）和 2型HSV(HSV-2，10-30% ;生殖器疱瘆，新生儿疱瘆）的群体的高感染率，并且由于该病毒 经常被重新激活，在感觉和自主神经节中持续终生潜伏，所以HSV具有特别的临床意义。与 病毒的类型无关，原发或复发性HSV感染的征候治疗目标是抑制病毒复制、缩短患病时间， 和预防影响复发频率的系统性并发症。
[0005] 在早识别和正确用药剂量的情况下，病毒抑制试剂被成功用于抗病毒治疗。最常 见的病毒抑制试剂（例如阿昔洛韦，喷昔洛韦，膦甲酸，碘苷）是核苷或焦磷酸盐类似物， 其共同的活性原理是基于在病毒感染的细胞中抑制DNA的合成。
[0006] 治疗HSV感染的最重要的治疗剂之一是嘌呤核苷类似物阿昔洛韦。其被病毒胸苷 激酶磷酸化，然后干扰病毒DNA聚合酶。与此相反，人的DNA聚合酶对于阿昔洛韦的易感性 仅有1/50至1/30,因此仅观察到边际效应。
[0007] 然而，虽然在选择性作用的病毒抑制试剂上有进展，但是病毒性疾病的化学治疗 仍然是严重的问题。特别地，在长时间的预防性和治疗性处理免疫抑制患者时观察到的针 对常见的化疗剂的抗性株系的出现是个问题。因此，在10%以上的病例中，由于缺乏有效的 病毒抑制试剂，观察到了迅速进展的泛发的感染，具有致死性进展。
[0008] 目前，焦磷酸盐类似物膦甲酸特别用于在免疫抑制患者中抵抗阿昔洛韦抗性疱瘆 病毒。该试剂引起病毒DNA聚合酶的直接抑制，并且对于胸苷激酶没有影响。然而，膦甲酸 的使用导致严重的不希望的副作用，例如肾衰竭、心脏问题、对于骨髓具有毒性，并且还可 能导致皮肤溃疡。由于其致畸形效应，在环孕期间也不能施用膦甲酸。此外，观察到交叉抗 性株系的形成，这使得替代性治疗剂的开发成为高度必需的。目前没有被动免疫预防。一 些针对HSV1和HSV2的主动免疫的实验性疫苗未显示出可证实的成功。
[0009] 抗体对于治疗癌症、自身免疫病症和病毒感染具有极大的前景。JP6135854描述了 针对单纯疱瘆病毒感染的治疗剂，其中通过静脉内点滴以注射的形式同时或相继施用针对 HSV的人单克隆抗体和抗病毒核酸类似物例如阿昔洛韦（ACV)。DK 187286公开了显示出 针对来自HSV-1和HSV-2的糖蛋白D(gD) (HSV gD-1和gD-2)的多特异性免疫反应性的抗 体。WO 1997/26329描述了对于诊断和治疗HSV-1和HSV-2有用的人单克隆抗体。后者的 抗体与HSV 863单克隆抗体竞争与HSV-1和HSV-2的糖蛋白D抗原的结合。US 4, 950, 595 公开了小鼠-人杂交瘤，其产生抗病毒-人抗体，其制备方法，以及抗病毒-人单克隆抗体。
[0010] 此外，描述了特异于HSV1/2的另一鼠单克隆抗体（Fd79) (Kogae et al.，1986)的 人源化（Co, M. S. et al.，1991 ;Zeitlin L. et al.，1998)。该抗体识别 HSV1 和 HSV2 的糖蛋 白B(gB)的共有表位。此外，已经在转基因植物和真核细胞系SP2/0中产生了人源化Fd79， 并随后进行了表征，显示出53nM的亲和性。
[0011] 鼠单克隆抗体H1815识别糖蛋白B(gB)的氨基酸263-283的区域中的相似但不同 的表位（Navarro et al.，1992)。然而，H1815不能进行病毒中和或抑制"细胞至细胞的传 播"。
[0012] 最后，US 6, 180,370描述了人源化的免疫球蛋白及其制备方法。此外，TO 2003/105782涉及鼠抗体特异性接枝至人框架。
[0013] 因此，化疗剂具有不希望的副作用，并且观察到数目渐增的抗性株系。
[0014] 因此，本发明的目标是提供能够中和HSV感染并抑制细胞至细胞的传播的（人源 化的）抗HSV抗体。此外，本发明的目标是提供用于治疗HSV相关疾病的预防剂和/或治 疗剂，其克服了常规应用的化疗剂的上述缺点。
[0015] 令人惊奇的是，发现根据本发明的抗体实现了该目标。因此，本发明提供了用于治 疗HSV感染的本领域已知的治疗剂的有前景的替代物，其是基于重组产生的抗体，其可以 是人源化的。这些抗体能够阻断病毒在宿主内传播的两种机理。它们有效地中和无细胞的 病毒颗粒，并抑制病毒的直接的细胞至细胞传播。由于该抗体特异性结合HSV1和HSV2被 膜的表面糖蛋白B (gB)的高度保守的表位，而gB对于病毒复制周期是必不可少的，所以，药 物抗性的出现是极不可能的。
[0016] 虽然本发明的鼠抗体的效应已经部分地被描述，见参考文献Eis-Hubinger et al. , Intervirology (1991) ;32:351-360 和 Eis-HUbinger et al. , Journal of General Virology (1993) ;74:379-385,但是从未公开过或使公众可获得抗体本身或本发明的抗体 的互补决定区（CDR)的序列，以及其所结合的表位。
[0017] 总之，（人源化的）抗体提供了以下一项或多项优点：
[0018]已经证明了本发明的鼠单克隆抗体的功效（见Eis-HUbinger et al.，1991 ; Eis-HUbinger et al.，1993)。此外，本发明人在实施例部分证明了本发明的人源化抗体也 能够在体外中和HSV1和HSV2病毒感染，并通过抑制"细胞至细胞传播"机制而抑制病毒传 播。在人类中的感染进展的情境中，人免疫系统不能产生用于有效预防HSV1/2典型性细胞 至细胞传播的抗体特异性。
[0019] 保守性化疗剂例如阿昔洛韦和膦甲酸的经常性和长期性的预防性以及治疗性 应用导致抗性病毒株系的形成增加。该抗性问题可以通过单独施用的或与病毒抑制试剂例 如阿昔洛韦和/或膦甲酸组合施用的本文描述的（人源化）抗HSV抗体得以克服，因为其 依赖于不同的作用机理。
[0020] 本文描述的抗体特异性结合HSV gB蛋白的表位。预期不会有针对本发明的抗 体的HSV抗性的出现，因为gB蛋白的突变会导致病毒感染力的丧失。
[0021] 禁忌系统性施用常规的病毒抑制试剂的患者特别地获益于本文描述的（人源 化）抗体。
【发明内容】
[0022] 因此，提供了包含如 SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID N0:4, SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的互补决定区的抗体。另外，提供了与包含SEQ ID NO:l-6所 示的互补决定区的抗体识别相同表位的抗体。
[0023] 此外，还提供了包含有效量的本文描述的抗体和至少一种药学上可接受的赋形剂 的药物组合物。
[0024] 此外，提供了包含编码如权利要求中定义的抗体的核苷酸序列的表达载体，包含 所述核苷酸序列的细胞，和能够产生所述抗体的杂交瘤细胞。
[0025] 最后，本文还提供了用作药物的如权利要求中定义的抗体，如权利要求中定义的 抗体用于制备用于预防性或治疗性处理受试者中的HSV相关疾病的药物的用途。
[0026] 如独立权利要求中所定义的本发明的各个方面和包含于从属权利要求中的优选 实施方式通过引用方式并入本文。
[0027] 发明详述
[0028]因此，在第一个方面，本发明涉及包含如SEQ ID NO: 1 (TSGMSVG)，SEQ ID NO:2 (HIWWNNDKYYKPALKS),SEQ ID NO:3 (IYYGYRPYAMDY),SEQ ID N0:4(RSSQSIVHSNGNTYLE),SEQ ID N0:5(KVSNRFS)和SEQ ID N0:6(FQGSHVPWS)所示的互补 决定区的抗体。
[0029] 抗体或免疫球蛋白是Y球蛋白，其天然形式由通过二硫键连接的两条大的重链 和两条小的轻链组成（参考图3)。有5种类型的哺乳动物Ig重链：a，6，e，y和y。所 存在的重链的类型确定了抗体的类（同种型）；它们分别是IgA，IgD，IgE，IgG和IgM抗体。 每条重链具有2个区域：恒定区和可变区。恒定区在相同物种的相同同种型的所有天然产 生的抗体中几乎是相同的。轻链也由1个恒定区和1个可变区组成。在哺乳动物中有2种 类型的免疫球蛋白轻链：X和k。
[0030] 虽然所有抗体的一般结构是非常相似的，但是给定抗体的独特性质是由可变区 (V)决定的。更具体地，可变环（在轻链（')上有3个，在重链（V H)上有3个）负责与抗 原的结合，即负责其抗原特异性。这些环被称作互补决定区（CDR)。由于来自VjPVj吉构 域的CDR都对抗原结合位点有贡献，所以，重链和轻链的组合决定了最终的抗原特异性，而 非单独的重链或轻链。
[0031] 如本文使用的术语"抗体"意指任何能够结合抗原的多肽，其中结合特异性由SEQ ID N0:1至6所示的⑶R决定。因此，"抗体"意在涉及包含至少一个抗原结合片段的任何 多肽。抗原结合片段至少由重链的可变结构域和轻链的可变结构域组成，按照"两个结构 域一起能够结合特异性抗原"的方式排列。"抗体"包括完整抗体或抗体片段，例如Fab-片 段、F (ab) 2_片段或scFv-片段（参考图3)。
[0032] 就术语"完整抗体"而言，意思是具有天然产生的抗体的典型的总体结构域结构 (即包含3或4个恒定域的重链和1个恒定域的轻链以及各个可变域）的任意抗体，虽然每 个结构域可以包含另外的修饰，例如突变、删除或插入，它们不改变总体的结构域结构。
[0033] "抗体片段"也包含至少一个如上文定义的抗原结合片段，并显示出与该片段所衍 生自的完整抗体相同的功能和特异性。Fab片段可以使用木瓜蛋白酶切割免疫球蛋白而产 生。木瓜蛋白酶在铰链区下切割，因此，在二硫键下切割，所以形成F(ab) 2片段。此外，重 链和轻链的可变区可以融合在一起以形成单链可变片段（scFv)。
[0034] 另外，术语"抗体"意在包括所有上述的免疫球蛋白同种型，即，抗体可以是 IgA，IgD，IgE，IgG或IgM抗体，包括这些同种型的任何亚类。优选地，抗体是IgG抗体，更优 选为IgGl或IgG2抗体。由于可以重组地表达和产生抗体，所以抗体也可以包含2个不同 的重链恒定区，例如，1个IgGl和1个IgG2重链，或来自不同物种的重链。然而，重链优选 来自相同的物种。此外，抗体可以包含X或k轻链。
[0035] 如实施例2所示，抗体的价数（valency)对于介导病毒中和以