一种鱼类前胸腺素α及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学领域，具体的说是一种鱼类（半滑舌鳎）前胸腺素a及其 应用。
【背景技术】
[0002] 前胸腺素a(ProTthymosinalpha,ProTTa)是一种强酸性蛋白，分子量约为 12. 5kDa。该蛋白的氨基酸组成中缺乏芳香族和含硫类氨基酸且没有固定的天然构象。前 胸腺素a可以被溶酶体天冬酰胺内肽酶水解，从而产生一个含有28个氨基酸的活性多 肽-胸腺素a 1。前胸腺素a主要作用于细胞的增殖和分化。越来越多的研宄表明，在哺 乳动物中，前胸腺素a拥有免疫调节以及细胞因子样的功能，例如可以刺激IL-2受体的上 调表达、促进树突状细胞的成熟、促趋化和抗感染活性等。哺乳动物前胸腺素a作为Tol 1 样受体TLR4的内生性配体可以刺激免疫调节因子I型干扰素的释放，进而有效激活杀伤性 T细胞和自然杀伤细胞。然而，鱼类前胸腺素a的功能和应用潜能尚不清楚。
【发明内容】
[0003] 本发明目的在于提供一种鱼类（半滑舌鳎）前胸腺素a及其应用。
[0004] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
[0005] 一种鱼类前胸腺素a重组蛋白，鱼类前胸腺素a重组蛋白为半滑舌鳎的前胸腺 素a重组蛋白，其是以半滑舌鳎cDNA为模板，用引物F1和R1进行PCR扩增前胸腺素a基 因，扩增产物经诱导表达、纯化即为重组蛋白，所述F1为5 ' -GATATCATGGCGGACAGCAAAG-3 ' ； R1 为 5' -GATATCCTGGTCTGTCTTCTGCT-3'。
[0006] 一种鱼类前胸腺素a重组蛋白的应用，所述半滑舌鳎的前胸腺素a重组蛋白可 应用于制备抑制抗病毒的制剂。
[0007] 所述病毒为细胞肿大病毒。
[0008] 本发明具有如下优点：本发明的前胸腺素a注射鱼类后能够显著提高鱼类的抗 病毒能力。
【附图说明】
[0009] 图1为本发明实施例提供的纯化的前胸腺素a蛋白电泳图。泳道1，分子量标准； 泳道2，前胸腺素a。
【具体实施方式】
[0010] 下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而 非以任何形式对本发明进行限制。
[0011] 在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法：
[0012] 1.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化、DNA片段从凝胶中回收皆使用"天根生化科技 (北京）有限公司"的相应试剂盒。
[0013] 2?大肠杆菌用Hanahan方法（SambrookandRussell:MolecularCloning: A LaboratoryMannual.ColdSpringHarborLaboratoryPress2001)〇
[0014] 3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于"纽英伦生物技术有限公司"，北京。
[0015] 实施例1
[0016] 前胸腺素a重组蛋白的制备
[0017] 1)表达前胸腺素a重组蛋白的质粒pPr〇T的构建：
[0018] 本发明的前胸腺素a序列已公布（GenBankaccessionnumber XM_008334972. 1)。前胸腺素a由103个氨基酸组成，没有固定的结构域，唯一保守的特征 是强酸性（等电点3. 6)。以半滑舌鳎cDNA为模板，用引物F1和R1进行PCR扩增前胸腺 素a基因。PCR条件为：94°C60s预变性模板DNA，然后 94°C40s，53°C60s，72°C60s，30 个循环后再在72°C延伸反应7 - 10min。PCR产物用天根的相应试剂盒纯化。将表达载体 pET259(构建过程参见HuYH,Zhengffff,SunL.Identificationandmolecularanalysis ofaferritinsubunitfromreddrum(Sciaenopsocellatus).FishShellfishImmunol 2010 ;28:678 - 86)用限制性内切酶EcoRV酶切后回收5. 3kb片段，将其与上述纯化的PCR 产物用T4DNA连接酶连接，连接液转化入大肠杆菌DH5a，在含卡那霉素（l〇〇ug/ml)的LB 培养基上培养18 - 24小时，筛选转化子提取质粒，命名为pProT。通过DNA测序分析证明 了pProT为含有强酸性（等电点3. 6)特征的胸腺素a序列的表达质粒，其中，pPr〇T质粒 中前胸腺素a序列与GenBankaccession公开的numberXM_008334972. 1序列一致。
[0019] 所述LB组成成分按重量百分比计：1. 0 %蛋白胨，0. 5 %酵母粉，1. 0 % 氯化钠，97. 5 % 蒸馏水。所述 F1 为 5' -GATATCATGGCGGACAGCAAAG-3' ；R1 为 5' -GATATCCTGGTCTGTCTTCTGCT-3'。
[0020] 2)前胸腺素a重组蛋白的诱导表达和纯化
[0021 ] 将上述的质粒pProT用常规方法转化大肠杆菌BL21 (DE3)(购自于"天根生化科技 有限公司"，北京），在含有卡那霉素（50ug/ml)的LB固体培养基上培养18 - 24小时，挑 取转化子，将其命名为BL21/pProT。
[0022] 将BL21/pPr〇T于含有卡那霉素（50ug/ml)的LB液体培养基中过夜培养；取1ml 过夜后的培养液，加入l〇〇ml新鲜的含有卡那霉素（50ug/ml)的LB液体培养基中，于37°C 下转速200rpm摇动培养至0D 6QQ为0. 6,加入终浓度为ImM的IPTG，28°C继续以转速160rpm 摇动培养5h，而后以5000g，4°C离心10min，收集菌液，加入5ml裂解液，在室温于摇床上缓 慢摇动1-2小时，直至菌悬液变澄清为止。将菌液以10000g，4°C离心30min，回收上清。将 上清中的蛋白用亲和层析柱His Trap HP Columns (购于美国GE Healthcare公司）回收 纯化。将纯化的蛋白经SDS-PAGE电泳检测（8v/cm电压下电泳25 - 30min，随后15v/cm电 压下电泳2 - 2. 5h)，测定其分子量大小（参见图1)。发现它的蛋白质质量与前胸腺素a 相同。
[0023] 所述裂解液为终浓度的10mM NaH2P04、10mM Tris和8M尿素，pH8. 0。
[0024] 实施例2
[0025] 前胸腺素a的应用
[0026] 步骤1)前胸腺素a的注射
[0027] 将上述实施例1纯化的前胸腺素a蛋白在PBS中稀释至200ug/ml，即为前胸腺 素a稀释液。将20条半滑舌鳎（重约13. 4g)随机分为2组，每组10条。将这2组分别 命名为A和B。将A组的每条鱼分别注射100ul前胸腺素a稀释液，将B组（对照组）的 每条鱼分别注射l〇〇ulPBS。
[0028] 所述PBS组成成分按重量百分比计：0. 8 %NaCl, 0. 02 %KC1, 0. 358 % Na2HP04. 12H20, 0? 024%NaH2P04,余量为水。
[0029] 步骤2)病毒悬液制备
[0030] 将细胞肿大病毒RBIV-C1(具体制备方法见ZhangM，XiaoZ，HuY，Sun L.Characterizationofamegalocytivirusfromculturedrockbream,Oplegnathus fasciatus(Temminck&Schlege)，inChina.AquacRes.2012;43:556 _64)于PBS中稀释 至106copies/ml，即为病毒悬液。
[0031] 步骤3)攻毒感染
[0032] 在上述步骤1)注射后第5小时，将A和B组的每条鱼注射100ul上述步骤2)的 病毒悬液。在感染后6天，取鱼脾脏和肾脏组织。利用DNA提取试剂盒（购于天根生化科 技（北京）有限公司"）从组织中提取DNA，用绝对定量PCR法检测组织中病毒含量（具体 方法见上述参考文献）。结果表明，A组鱼脾脏和肾脏的病毒数（分别为2xl04和8x103)显 著（P〈〇.01)低于B组鱼脾脏和肾脏的病毒数（分别为lxlO5和2x10 4)。
[0033] 这些结果表明，前胸腺素a能够显著增强鱼类抵抗病毒的侵染。
【主权项】
1. 一种鱼类前胸腺素 α重组蛋白，其特征在于：鱼类前胸腺素 α重组蛋白为 半滑舌鳎的前胸腺素 α重组蛋白，其是以半滑舌鳎cDNA为模板，用引物Fl和Rl进 行PCR扩增前胸腺素 α基因，扩增产物经诱导表达、纯化即为重组蛋白，所述Fl为 5' -GATATCATGGCGGACAGCAAAG-3' ；R1 为 5' -GATATCCTGGTCTGTCTTCTGCT-3'。
2. -种权利要求1所述的鱼类前胸腺素 α重组蛋白的应用，其特征在于：所述半滑舌 鳎的前胸腺素 α重组蛋白可应用于制备抑制抗病毒的制剂。
3. 权利要求2所述的鱼类前胸腺素 α重组蛋白的应用，其特征在于：所述病毒为细胞 肿大病毒。
【专利摘要】本发明涉及分子生物学领域，具体的说是一种鱼类(半滑舌鳎)前胸腺素α及其应用。鱼类前胸腺素α重组蛋白为半滑舌鳎的前胸腺素α重组蛋白，其是以半滑舌鳎cDNA为模板，用引物F1和R1进行PCR扩增前胸腺素α基因，扩增产物经诱导表达、纯化即为重组蛋白。本发明前胸腺素α蛋白注射鱼类后能够显著提高鱼类的抗病毒能力。
【IPC分类】A61K38-22, A61P31-20, C07K14-575
【公开号】CN104650218
【申请号】CN201510096179
【发明人】孙黎, 张宝存
【申请人】中国科学院海洋研究所
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2015年3月4日