4连体胸腺素α1基因序列及转基因番茄的制备方法

专利名称：：4连体胸腺素α1基因序列及转基因番茄的制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种基因工程领域的植物基因序列及转基因的方法，具体地，涉及一种4连体胸腺素a1基因序列及转基因番茄的制备方法。
背景技术：
：胸腺素a1(Thymosina1，Ta1)在临床被广泛用于免疫缺陷、病毒感染和自身免疫性疾病治疗，对肝炎(HBV和HCV)、爱滋病(HIV)、癌症(cancer)和糖尿病(diabetes)治疗取得了满意的效果。目前，胸腺素a1生产主要采用组织提取、化学合成和基因工程法。由于组织来源有限和化学合成法的成本高，使胸腺素a1在临床应用受限。利用基因工程法生产胸腺素a1具有潜力，特别是利用植物系统生产胸腺素a1在安全性和降低成本方面均具有明显优势。经对现有技术文献的检索发现，大肠杆菌(Escherichiacoli)和酵母(Pichiapastoris)是目前基因工程法生产胸腺素al(Tal)主要表达系统，如"利用大肠杆菌表达串联胸腺素a1"Chenetal(Biotechnol.Appl.Biochem.，2008，49:5卜56)和"构建、表达和鉴定毕赤酵母源的干扰素a2b_胸腺素al融合蛋白"Yangetal(WorldJGastroenterol.，2005，11(17):2597-602)的研究分别在大肠杆菌和毕赤酵母中成功地表达了人源胸腺素al。源自大肠杆菌和酵母系统的生物产品需经过纯化加工才能在临床应用，而纯化加工需要必要的设备支撑和昂贵的培养基，使胸腺素al生产成本提高。同时，加工过程中二次污染和纯化试剂影响胸腺素a1安全性和生物活性的问题难以克服。特别是微生物系统生产的重组蛋白难以去除内毒素污染和酵母系统蛋白修饰的缺陷目前尚无法克服。
发明内容本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种4连体胸腺素a1基因序列及转基因番茄的制备方法。通过构建植物表达载体，在植物中表达有胸腺素al活性多肽，产品对提高人体免疫力，防止和治疗人类重大疾病如肝炎、艾滋病、癌症和糖尿病方面具有重要应用价值。本发明是通过以下技术方案实现的本发明所涉及的4连体胸腺素a1基因序列，通过按植物偏爱密码子原则设计合成有胸腺素a1的4XTa1核苷酸序列，构建植物表达载体，提供了一种按植物偏爱密码子设计合成的DNA分子，该分子包括编码具有胸腺素al活性多肽的4XTal核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列与SEQIDNO.2中从核苷酸第16-408位的核苷酸序列有至少70%的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQIDNO.2中从核苷酸第16-408位的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码具有SEQIDNO.3所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQIDNO.2中从核苷酸第16-408位的核苷酸序列。在本发明提供的在植物中表达的胸腺素4XTa1，它包括具有SEQIDNO.3氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQIDNO.3序列的多肽。在本发明的几种表达载体，它包含上述的DNA分子。本发明所涉及的利用植物系统表达胸腺素a1功能蛋白的方法，该方法包括如下的步骤(1)含目的基因(4XTal)表达载体的构建将含有4XTal基因的克隆载体质粒进行酶切，回收目标DNA片段，获得带有相应的粘性末端的目的基因4XTal，然后将其克隆到植物表达载体中，通过测序或酶切鉴定，在确保表达载体中的目的基因阅读框架正确的前提下，再将表达载体质粒用冻融法转入农杆菌中，获得包含目的基因表达载体的工程菌；(2)植物遗传转化①将灭菌后的植物种子播于发苗培养基上，待子叶展开后，将子叶或下胚轴剪成小片作为外植体用于转化；②将含有目的基因表达载体的工程菌于2『C摇菌培养至OD6。。=0.81.0时，室温6，000g离心58min;③弃上清，菌体用液体MS培养基重悬，然后加入准备好的包括子叶和下胚轴在内的外植体浸泡8~10分钟；将浸染结束后的外植体取出，吸去表面残余菌液；然后将外植体置于共培养培养基上在25'C共培养36小时；⑤共培养结束后将外植体转移到分化培养基上，在2528。C光照下培养，3、周可见形成抗性愈伤组织或再生芽；◎待再生芽长至约3-4厘米时，将其切下移植到生根培养基上进行生根培养，710天左右生根；⑦根系发达后，将植株取出，用无菌水洗去附着在根系上的固体培养基，在珍珠岩中驯化并用质量体积百分比为1%的MS粉水溶液补充营养和水分，一周后移入土中。所述发苗培养基的各组成成分的质量百分比为MS粉为0.22%，蔗糖为3%，植物凝胶为0.26%，余量为蒸馏水。该发苗培养基的pH值为5.8。所述液体MS培养基的各组成成分的质量百分比为MS粉为0.44%，蔗糖为3°/。，余量为蒸馏水。该液体MS培养基的pH值为5.8。所述共培养培养基的各组成成分的质量百分比为MS粉为0.44%，蔗糖为3%，植物凝胶为O.26%，6-苄氨基嘌呤为0.0002%，吲哚乙酸为0.00002%，余量为蒸馏水。该共培养培养基的pH值为5.8。所述分化培养基的各组成成分的质量百分比为MS粉为0.44%，蔗糖为3%，植物凝胶为0.26%,6-苄氨基嘌呤为0.0002%，吲哚乙酸为0.00002%,卡那霉素为0.005%，羧苄青霉素为0.025%，余量为蒸馏水。该分化培养基的pH值为5.8。所述生根培养基的各组成成分的质量百分比为MS粉为0.44%,蔗糖为3%，植物凝胶为0.26%，6-苄氨基嘌呤为0.0002%，吲哚乙酸为0.00002%，卡那霉素为0.005%，羧苄青霉素为0.025%，余量为蒸馏水。该生根培养基的pH值为5.8。在本发明中，按植物偏爱密码子设计合成的胸腺素al(Tal)基因序列如SEQNO.1所示。所述的"利用基因工程手段"是指利用限制性内切酶粘性末端的特点和DNA重组技术，在本发明中将SEQIDNO.1(Tal基因)构建成线性4连体融合基因，g卩4XTal(以下同)。本发明所述的4XTa1基因序列如SEQN0.2所示。本发明还包括一种SEQIDNO.2核酸序列所编码的多肽，它包括具有SEQIDNO.3氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQIDNO.3序列的多肽。在本发明中，术语"4XTa1蛋白或多肽的编码序列"是指编码具有生物活性的线性相连的4连体胸腺素a1多肽的核苷酸序列，如SEQIDNO.2中第16-408位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQIDNO.2序列编码框的第16-408位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氮基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQIDNO.2中第16-408位核苷酸序列同源性低至约75%的简并序列也能编码出SEQIDNO.3所述多肽的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳的在高度严紧条件下与SEQIDNO.2中从核苷酸第16-408位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQIDNO.2中从核苷酸第16-408位的核苷酸序列的同源性至少75%，较佳地至少80%，更佳地至少90%，最佳地至少95%的核苷酸序列。该术语还包括能编码具有与天然的胸腺素a1相同功能蛋白的SEQIDNO.1或SEQIDNO.2中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5'和/或3'端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。在本发明中，术语"4XTal蛋白或多肽"是指具有生物活性胸腺素al的SEQIDNO.3序列的多肽。该术语还包括具有与4XTa1蛋白或多肽在植物中表达相同功能的SEQIDNO.3序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为l-20个，较佳地1-15个，更佳地1-10个，最佳地l-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为15个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个植物偏爱密码子所表达的氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括在植物中表达4XTa1蛋白或多肽的活性片段和活性衍生物。本发明4XTal蛋白或多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与编码4XTal蛋白或多肽DNA分子杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗胸腺素al的抗血清获得的多肽或蛋白。在本发明中，"4XTa1保守性变异多肽"是指与SEQID\'0.3的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸替换所形成的多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。表14XTal保守性变异多肽氨基酸替换表<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>本发明还包括4XTci1蛋白或多肽类似物。这些类似物与4XTa1蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如e、Y-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述列举的代表性多肽。修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工歩骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。以下对本发明序列的内容进一步描述一、本发明的按植物偏爱密码子设计人工合成4XTa1与牛人工合成胸腺素al核苷酸序列(GenBankAccessionNo.J02524.1)、鼠胸腺素a1(GenBankAccessionNo.丽008972.1)和人的胸腺素a1(GenBankAccessionNo.AK314106.1)同源比较(GAP)，相同的核苷酸在两个序列之间用竖线符标出。1.本发明按植物偏爱密码子设计人工合成4XTa1与牛人工合成胸腺素a1核苷酸序列同源比较(GAP)如表1:90%identityin87ntoverlapquery25atgtctgatgctgctgttgatacctcttctgagatcaccaccaaggatcttaaggagaag84mmiiiiimiimiMimiimm111111mmiiimmsbjct6atgtctgatgctgctgttgatacttcttctgagattactactaaagatcttaaggagaag65query85犯ggaggttgttgaggaggctgagaac111milmiliimiiimmsbjct66aaggaagttgtcgaagaggctgagsac92Query:按植物偏爱密码子设计人工合成的4XTa1核苷酸序列Sbjct:牛人工合成胸腺素a1核苷酸序列表1按植物偏爱密码子设计人工合成的4XTa1与牛人工合成胸腺素a1核苷酸序列同源比较(GAP)。2.本发明按植物偏爱密码子设计人工合成的4XTa1与鼠胸腺素a1核苷酸序列同源比较(GAP)如表2:82%identityin86ntoverlapquery25atgtctgatgctgctgttgatacctcttctgagatcaccaccaaggatcttaaggagaag84miiiiiiiiimmiimiimii!i出hiiiMiMiisbjct171a_tgtcagacgcggca_gtgg3taccagctccgagatC￡Lccacc3￡iggacttgaagg￡ig'afig230query85aaggaggttgttgaggaggctgagaa110MMimimimilsbjct2313tgga3gttgt.ggaggaggcEigag'朋256Query:按植物偏爱密码子设计人:l:合成的4XTa1核tf酸序列Sbjct:鼠胸腺素a1核苷酸序列表2按植物偏爱密码子设计人工合成的4XTa1与鼠胸腺素a1核苷酸序列同源比较(GAP)。3.本发明按植物偏爱密码子设计人工合成的4XTa1与人胸腺素ci1核苷酸序列同源比较(GAP)如表3:77%identityin86ntoverlapquery25atgtctgatgctgctgttg.atacctcttctgagatcaccaccaaggatcttaaggagaag84sbjct178atgtcagacgcagccgtagacaccagctccgaaatcaccaccaaggacttaaaggagaag237query85aaggaggttgttgaggaggctgagaa110milmiliimiliiiisbjct238aaggaagttgtggaagaggcagaaaa263Query:按植物偏爱密码子设计人工合成的4XTa1核苷酸序列Sbjct:人胸腺素a1核苷酸序列表3按植物偏爱密码子设计人工合成的4XTa1与人胸腺素a1核苷酸序列同源比较(GAP)。二、本发明的按植物偏爱密码子设计的4XTa1蛋白与人胸腺素a的氨基酸序列(GenP印tAccessionNo.D33356)和鼠胸腺素a的氨基酸序列(GenP印tAccessionNo.XP—924792)的同源比较(FASTA),其中，相同的氨基酸在两个序列之间用用竖线符标出。1.本发明按植物偏爱密码子设计的4XTa1与人胸腺素(i的氨基酸序列同源比较(FASTA)如表4:93%identityin29aaoverlapQuery:4MSDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEN32iiiiiimmiiiiiimiiiiiiSbjct:1MSDAAVDTSSEITTKDLK-KKEAVEEAEN28Query:按植物偏爱密码子设计的4XTa1氨基酸序列Sbjct:人胸腺素a的氨基酸序列表4按植物偏爱密码子设计的4XTal与人胸腺素a的氨基酸序列同源比较(FASTA)。2.本发明的按植物偏爱密码子设计的4XTci1与鼠胸腺素ci的氨基酸序列同源比较(FASTA)如表5:Sbjct:1MSDAAVDTSSEITTKDLKEKKEAVAEKAEN29Query:按植物偏爱密码子设计的4XTa1氨基酸序列Sbjct:鼠胸腺素a的氨基酸序列表5按植物偏爱密码子设计的4XTa1与鼠胸腺素a1的氨基酸序列同源比较(FASTA)。本发明利用植物系统表达所述基因编码功能蛋白分子的技术体系，该技术体系包括载体构建、植物遗传转化、分子检测和功能蛋白活性鉴定。本发明所述的载体，可选用本领域己知的各种市售载体，包括如质粒、粘粒和A噬菌体等。在植物中表达或生产本发明的4XTa1蛋白时，可以将4XTa1蛋白编码序列可操作性地连于表达调控序列，从而形成含4XTa1的表达载体。它们包含SEQIDNO.2的DNA分子；一种核酸分子，它们包含所述的DNA分子中8-100个连续核苷酸。在本发明所用"可操作地连于"指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA;如果启动子控制DNA序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般地，"可操作地连于"意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。在本发明中，术语"植物遗传转化"是将载体所携带的4XTa1或同源序列导入到植物的细胞，包括该领域常用的农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法或病毒转染法。术语"导入植物细胞"是指将所述基因整合到植物的核基因组、细胞器基因组或在植物细胞器中瞬间表达。术语"宿主细胞"为真核细胞，常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、生菜细胞、番茄细胞、油菜或其它植物细胞，在900/oidentityin30aaoverlapQuery:4MSDAAVDTSSEITTKDLKEKKE-VVEEAEN32本发明的实施例中宿主细胞是番茄细胞。本发明检测样品中是否存在4XTal核苷酸序列的方法，它包括分子杂交和PCR方法分子杂交检测技术是指利用探针分子与样品分子杂交技术手段，通过检测探针是否发生了结合从而确认样品中是否存在4XTa1核苷酸序列。较佳地，该样品是含4XTa1核苷酸序列的真核生物基因组DNA或PCR扩增后的产物。本发明的可用作探针的核酸分子，该分子通常具有4XTa1核苷酸编码序列的8-50个连续核苷酸，较佳地具有15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码胸腺素al(Tal)或4XTal的核酸分子。本发明4XTa1蛋白或多肽的核苷酸编码序列通常可以用人工合成带相应限制性内切酶位点的单体结合基因工程技术或人工合成方法获得。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。PCR技术也可以用于检测样品中是否存在4XTa1核苷酸序列，所用引物对应于4XTal蛋白核苷酸编码序列，也可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为15-50个核苷酸。用Nothern印迹法或RT-PCR技术可以分析4XTa1基因转录情况，即分析4XTa1的转录物RNA在细胞中的存在与否和数量。4XTa1基因RNA的Northern印迹或/和RT-PCR分析以及特异抗体的4XTa1蛋白Western印迹分析联合使用，可以证实在生物样本中4XTa1蛋白的表达。本发明检测植物中表达4XTal蛋白生物活性方法，植物中表达4XTa1蛋白是指4XTa1的DNA序列在植物细胞中成功地编码具有SEQIDNO.3氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。用于生物活性检测的4XTal蛋白可以是含有4XTal的总可溶蛋白或纯化的4XTal蛋白；可以用分子生物学或生物化学研究领域通用的技术提取或分离纯化如免疫层析和亲和层析技术获得，在本实施例中用PBS法提取含4XTa1的总可溶蛋白。用Westernblot和ELISA技术可以检测植物样品中是否存在4XTal蛋白，还可以对4XTa1蛋白定量和检测免疫活性。所述的4XTcil蛋白活生物性检测方法是指利用本领域常用的胸腺素ci1生物活性检测方法如MTT技术和肝炎鼠模型，在本实施例中植物表达4XTa1蛋白活性检测用MTT方法。本发明开辟了4XTa1蛋白生产的新途径，与
背景技术：
中的生产方法向比较可以降低生产成本，对于克服胸腺素a1生产现有技术的不足具有重要理论意义和应用价值；本发明的方法按植物偏爱密码子设计人工合成的4XTa1在植物系统表达其活性的生物产品对提高人体的免疫力，预防和治疗人类重大疾病如肝炎(HBV、HCV)、爱滋病(HIV)、癌症(cancer)和糖尿病(diabetes)方面具有重大作用及应用价值。本发明还提供了一种检测、分析DNA样品中是否存在4XTal基因，蛋白样品中是否含有4XTcil蛋白的研究方法，并对所述蛋白功能进行了初步研究，为进一步的研究奠定了基础。图l转基因番茄聚合酶链式反应(PCR)检测结果其中泳道1为DL2000DNA分子量标准；泳道2为含表达载体质粒PG-pRD12-4XTal的农杆菌EHA105作模板的阳性对照；泳道3为非转基因番燕的阴性对照；泳道4到泳道8为转基因番茄植株8，11，12，19和43。图2转基因番茄DNA分子杂交(Southernblot)分析图；其中左侧的数字是与酶切的基因组DNA共分离的A/HindIII的DNA分子量标准；泳道1为非转基因番茄植株；泳道2到泳道5为独立的转基因番琉植株8，11，12和43。图3用半定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测4XTa1基因在转基因番茄的转录水平表达示意其中左图表示4XTal基因在转基因番茄株系8的绿果、叶片和成熟果实中表达；CK为从非转基因番燕植株的绿果、叶片和成熟果实提取RNA;泳道l至泳道3分别为绿果、叶片和成熟果实；18S核糖体RNA(rRNA)基因为RM用量的标准对照；图中数字为3次重复的平均值。图4转4XTal基因番茄总可溶蛋白分析图中A为转4XTa1基因番茄总可溶蛋白的十二垸基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离；B为蛋白免疫印迹(Westernblot)分析示意；泳道M为蛋白分子量标准；泳道l为源自大肠杆菌(E.coli)系统的4XTa1蛋白的阳性对照；泳道2为源自非转基因番茄成熟果实的总可溶蛋白；泳道3和泳道4为源自转基因番茄株系8和株系11的成熟果实总可溶蛋白；图左侧的数据为蛋白分子量大小标准；图右侧箭头所标记的数字表示14.6kDa的4XTa1蛋白。具体实施例方式下面结合实验室具体的试验数据和实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例14XTa1基因合成及载体构建1.基因合成(genesynthesis)本发明的按植物偏爱密码子设计合成的胸腺素al(Tal)基因全长为124bp(包括保护碱基和酶切位点组成的接头)，详细序列见SEQIDNO.1;合成之后连入pUC18载体，即pUC18-Ta1。根据XbaI和SpeI同尾酶特性、利用DNA重组手段构建线性4连体胸腺素a1基因(4XTal)，然后连入pCAMBIA2300，即pCA2300-4XTa1。2.酶切(digestionoftherestrictionenzyme)用BamHI及SacI双切pCA2300-4XTa1，获得带有BamHI及SacI粘性末端(与表达载体相同)的4XTa1基因DNA片段；3.连接(ligation)将切下的4XTa1基因连入已经用BamHI及SacI切好的质粒pRD12(带有PG启动子)植物双元表达载体大片段中，构建PG-pRD12-4XTa1，用PCR方法检测转化的大肠杆菌，从而获得阳性克隆。4.基因PCR检测①中间载体质粒pCA2300-4XTal检测PC財广增体系25叱(体系各项试剂除所用模板外均由TaKaRa公司提供，后同)，包括引物TalF(5，-ggtaccatgtctagaatgtctgat-3，)禾口TalR(5，-gagctcttaactagtcatgttctc-3')各l叱(脂1/L),0.TaqDNA聚合酶(5unitsMJ，2.5叱的10XPCR缓冲液，1.5叱的MgCl2(25画1/U,2叱模板(待检菌液)，1.5叱的dNTPs(2.5腿ol/L)，15.2uL去离子无菌水，上覆20uL灭菌石蜡油；PCR条件94°C8min;94。C45s，55°C45s，72°C1min(35循环)；72'C延伸8min;电泳检测PCR扩增产物，获得扩增片段长度为408bp。②植物双元表达载体质粒PG-pRD12-4XTa1检测PCR扩增体系25l^L，包括引物PGF(5'-ggagaagacaagccagacaa-3，)和PGR(5'-agatcctctagactattgtcc-3，)各lpL(10刚/L)，0.T叫DNA聚合酶(5units/rtJ，2.5^L的10XPCR缓冲液，1.5^L的MgCl2(25mmol/L)，2nL模板(待检菌液)，1.5叱的dNTPs(2.5隱ol/L)，15.2uL去离子无菌水，上覆20yL灭菌石蜡油；PCR条件94°C8rain;94。C45s，55°C45s,72°C1min(35循环)；72'C延伸8min;电泳检测PCR扩增产物，获得扩增片段长度为708bp。实施例24XTa1基因序列信息与同源性分析本发明的4XTa1基因全长为417bp(含保护碱基和酶切位点组成的接头)，详细序列见SEQIDNO.2;其中开放读框位于16-408位核苷酸。据此所推导出的全长胸腺素a1的氨基酸序列共131个氨基酸残基，分子量Mw=14，595.12，等电点pb4.43。详细序列见SEQIDNO.3。将按植物偏爱密码子设计合成的4XTal基因全长序列及其编码蛋白质用BLAST程序在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB禾nNon-redundantGenBankCDStranslations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与牛人工合成胸腺素a1核苷酸序列(GenBankAccessionNo.J02524.1)、鼠胸腺素a(GenBankAccessionNo.NM008972.1)和人的胸腺素a(GenBankAccessionNo.AK314服1)核苷酸序列的同源性分别为90%、82%和77%(见表1-表3);在氨基酸水平上，它与人胸腺素a的氨基酸序列(GenP印tAccessionNo.D33356)和鼠胸腺素a的氨基酸序列(GenP印tAccessionNo.XP_924792)的同源性分别为93%和90%(见表4-表5)。由上可见，4XTa1基因与人和鼠的胸腺素a1基因无论是在核酸水平还是所编码的蛋白(多肽)氨基酸序列均具有较高的同源性，可以认为它们在功能上也有很高相似性。实施例3胸腺素Ta1在番茄细胞中进行真核细胞表达1.含目的基因(4XTal)表达载体构建用BamHI和SacI将含有4XTa1基因的克隆载体质粒pCA2300-4XTa1进行酶切，用胶回收试剂盒(华舜生物技术有限公司，上海)回收目标DNA片段，获得带有相应的粘性末端的目的基因4XTa1，然后将其克隆到植物双元表达载体PG-pRD12(不限于此，也包括如PBI121或改造过的pCAMBIA2300等植物表达载体)中，通过测序或酶切鉴定，在确保表达载体中的目的基因阅读框架正确的前提下，再将表达载体质粒用冻融法转入农杆菌(如EHA105)中，并通过农杆菌介导法转化番茄。2.番茄遗传转化将灭菌后的番茄种子(75%乙醇1分钟和20%次氯酸钠10分钟)播于1/2MS培养基上，约68天待子叶展开后，将子叶或下胚轴剪成小片(小段)作为外植体用于转化；②将工程菌(含PG-pRD12-4XTa1的农杆菌EHA105)于28"摇菌培养至0D6。。=0.81.0时，室温6，OOOg离心58min;③弃上清，菌体用1/2MS液体培养基重悬，然后加入准备好的外植体(子叶或下胚轴)浸泡810分钟；④将浸染结束后的外植体取出，用无菌吸水纸吸去表面残余菌液；然后将外植体置于MS1培养基(MS+ZTl.Omg/L+IAA1.Omg/L)上共培养36小时；⑤共培养结束后将外植体转移到含Kan的分化培养基(MS+ZT1.Omg/L+IAAl.Omg/L+Kan75mg/L+cb250rag/L)上，在2S28。C光照下培养，3、周可见形成抗性愈伤组织或再生芽；⑥待再生芽长至约3-4厘米时，用无菌手术刀将其切下移植到生根培养基(1/2MS)上进行生根培养，710天左右生根;⑦根系发达后，将植株取出，用无菌水洗去附着在根系上的固体培养基，在珍珠岩中驯化并用P/。的MS补充营养和水分，一周后移入土中。3.转基因番茄PCR检测①基因组DNA提取用CTAB法提取番茄基因组DNA(StewartandVia，1993)，取50ng番茄基因组DNA作模板进行PCR检测；②PCR扩增体系(25I4J包括引物PGF(5'-ggagaagacaagccagacaa-3，)禾口PGR(5'-agatcctctagactattgtcc-3，)各1^L(10幽/L)，0.3化T叫DNA聚合酶(5units/叱)，2.5PL的10XPCR缓冲液，1.5叱的MgCl2(25mmol/L)，2叱番茄基因组DNA模板(50ng)，1.5叱的dNTPs(2.5咖ol/L)，15.2uL去离子无菌水，上覆20nL灭菌石蜡油；③PCR条件94。C8min;94。C45s，55。C45s，72°C1min(35循环)；72'C延伸8min;电泳检测PCR扩增产物，获得扩增片段长度为708bp;④PCR产物检测:用带有EB(ethidiumbromide)的l.0%(w/v)琼脂糖胶在1XTAE电泳缓冲液中电泳，然后在凝胶成像系统紫光下检测并拍照；见附图I。4.转基因番茄Southernblot分析①番戒基因组DNA提取和转膜用CTAB法提取番茄嫩叶基因组DNA(StewartandVia,1993)，取30yg番茄基因组DNA用BamHI酶切，用1%琼脂糖胶进行电泳分离，然后转移到HybondN+膜上(AmershamPharmacia,Uppsala,Sweden);②探针标记、杂交和信号检测用BamHIandSacI从质粒p2300-4XTal切下417bp含4XTa1基因DNA片段，用于探针标记；探针标记、杂交和信号检测使用GeneImagesRandomPrimerLabelingmethod禾口CDP—Stardetectionmodule试剂盒(AmershamPharmacia)，按生产厂家操作说明书指导进行。在62'C杂交12小吋后，用洗膜液I(1XSSC和O.1%SDS)在62'C下洗杂交膜2次(各15分钟)，然后用洗膜液II(0.5XSSC和0.1%SDS)在62匸下洗杂交膜1次(15分钟)；滴加显色液后将杂交膜置于富士X-光片上暴光2-3小时检测杂交信号；见附图II。5.用RT-PCR检测4XTa1在转基因番茄中转录①RNA提取:按植物抽提试剂盒(华舜生物技术有限公司，上海)厂家说明抽提番茄叶片、绿果和成熟果实的总RNA;RNA模板预先用DNaseI(RNase-free，TaKaRa)处理以去除来自于番燕基因组DNA的污染；②RT-PCR体系用one-st印RT-PCR试剂盒(Takara,Japan)进行RT-PCR分析；RT-PCR扩增体系为50l^L，包括5PL的lOXOne-st印RNAPCR缓冲液，I(Mj的MgC12(25mM)，5叱的dNTPs(10mM)，l叱的RNaseInhibitor(40UA4J，l叱的AMV-OptimizedTaq(5U/叱)，l叱的AMV-RTaseXL(5UAO，TalF(5，-ggtaccatgtctgatgctg-3，)(10南/1)和TalR(5，-gagctcttaactagtcatg-3，)(10幽/U各H的TotalRNA(lPg/ML)，24Mi的RNaseFreewater;③RT-PCR扩增条件RNA模板在50。C条件下逆转录30rain;95。C变性2min，随后95°Cfor45s,52°Cfor45sand72。Cfor1min(28个循环)；最后在72。C延伸8min。管家基因(18SrRNA)RT-PCR检测作为18Sr脂A内源标准RT-PCR检测弓l物为18SF(5，-atgataactcgacggatcgc-3，)禾口18SR(5，-cttggatgtggtagccgttt-3');反应体系和反应参数与番燕样品RT-PCR条件相同。⑤RT-PCR产物检测用1°/。琼脂糖胶分离RT-PCR产物，每一样品4XTci1转录水平通过使用凝胶成像系统FR-200A(FuRiTech,Shanghai,China)自动分析功能进行计算；附图III。6.用westernblot检测4XTa1蛋白在转基因番茄果实中的表达①蛋白提取(在冰浴上进行)a.取5g番茄果实(绿果和成熟果)，在加有液氮的研钵中研磨成粉末，然后转移至50mL聚丙烯离心管中，并加入5mLIXPBS(歸040.2g/l，Na2HP041.15g/1,KC10.2g/l，NaCl8g/1);b.13000rpm4。C离心30分钟；c.收集上清于另一新离心管中备用。②蛋白定量参考Bradford法(Bradford,1976)，取2ul蛋白样品加98叱Bradford试剂混匀后，在酶标仪下(Bio-TEK，USA)测0D舰的吸光值。③SDS-PAGE分离蛋白SDS-PAGE制备参考《分子克隆》(Sambrook等，1989);a.样品中加入等体积的含50mmol/LDTT加样缓冲液(2X加样缓冲液甘油2.4g,1MTris-HClp朋.8lml;溴酚兰0.01%，H20定容至20ml)，沸水浴IO分钟后置于冰上，冷却后上样；b.4'C冰箱中在100V电压下进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，直到指示剂(溴酚兰)前沿达到凝胶底部；c.聚丙烯酰胺凝胶，其中一块用于考马斯亮兰(w:v=2.5%)染色，另一块用于Westernblot分析。④蛋白质向硝酸纤维膜上转移a.转移之前，用转移缓冲液(39mmol甘氨酸，48mmolTrisBase,0.037%SDS，20%甲醇)平衡凝胶和硝酸纤维膜30分钟；b.室温下用半干式电转仪转移lh,凝胶两侧各垫3层Whatman滤纸；⑤硝酸纤维膜蛋白检测c.将硝酸纤维膜浸在封闭液中，37°C缓慢摇动、封闭60分钟(封闭液取5g脱脂奶粉溶于100ml的lXPBS(含0.5g叠氮钠))；d.再将滤膜浸泡在洗涤缓冲液中，37°C洗涤两次，每次15分钟；e.加入第一抗体(抗胸腺素Tal的抗体)，37。C温育30分钟；同步骤b，洗涤三次；f.加入第二抗体(亲和素-碱性磷酸酶复合物)，37°C温育30分钟；同步骤b，洗涤两次；g.加入底物显色观察蛋白条带，见附图IV。7.番茄表达4XTa1蛋白生物活性检测用MTT[3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide]法检测番茄表达的4XTa1蛋白生物活性[Mosmann,T.(1983)J.Immunol.Methods65,55-63]。①用PBS法提取转基因和非转基因番茄果实总可溶蛋白，经滤膜(Millip。re，0.45幽)除菌后，用1XPBS将浓度调整至O.5Pg/叱。②鼠脾细胞分离自68周龄BALB/c鼠，并在1000g下离心10分钟收集脾细胞，随后鼠脾细胞用RPMI-1640液体培养基稀释成1X105细胞/mL，取稀释好的鼠脾细胞在96孔板上每孔加入100叱；③随后取100A标准化学合成的Tal蛋白(5ng/rtJ(普飞生物工程有限公司合成，上海)和番茄总可溶蛋白(0.5PgA4J加入96孔板，3次重复；④化学合成Tal蛋白和非转基因番茄果实总可溶蛋白分别作为阳性和阴性对照；⑤将96孔板放在37。C的C02(v/v=5%)细胞培养箱中培养24小时，然后每孔中加入15叱的MTT试剂，再培养4小时；⑥在倒置显微镜(OlympusCKX31，J邻an)下定期地观察96孔板细胞，当有清晰可见的紫色沉淀产生时，每一孔中加入100叱的DMS0(dimethylsulfoxide),随后轻轻地摇动96孔板，并将96孔板在室温下(黑暗)放置15分钟;⑦在酶标仪(Bio-TEK，USA)读OD训的吸光值；⑧脾细胞增殖率由下式求得增殖率(％)=(A样品-A对照)/A样品。转基因番茄的4XTci1蛋白生物活性的MTT检测结果，如下表1所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>其中CK表示非转基因番茄成熟果实；A57。是在波长570nm下吸光值的3次重复均值；X指lOOngTa1促进鼠脾细胞增殖率平均值(％);S.D.指示的是标准差。本发明涉及的序列及记号分列如下(1)SEQIDNO.1信息(i)序列特征(A)长度124碱基对(B)类型核苷酸(C)链性:双链(D)拓扑结构线性(ii).分子类型核苷酸(iii).序列描述:SEQIDNO.1GGGGTACCATGTCTAGAATGTCTGATGCTGCTGTTGATACCTCTTCTGAG50ATCACCACCAAGGATCTTAAGGAGAAGAAGGAGGTTGTTGAGGAGGCTGA100GAACATGACTAGTTAAGAGCTCGG124(2)SEQIDNO.2信息(i)序列特征(A)长度417碱基对(B)类型核苷酸(C)链性双链(D)拓扑结构线性(ii).分子类型核苷酸(iii).序列描述:SEQIDNO.2<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>序列表〈110>上海交通大学<120>4连体胸腺素a1基因序列及转基因番茄的制备方法〈140〉〈141>〈160〉2<170〉PatentInversion3.1<210>1<211>417〈212〉■<213>4XTal蛋白〈400>1GGATCCCCGGGTACCATGTCTAGAATGTCTGATGCTGCTGTTGATACCTC1TTCTGAGATCACCACCAAGGATCTTAAGGAGAAGAAGGAGGTTGTTGAGG51AGGCTGAGAACATGACTAGAATGTCTGATGCTGCTGTTGATACCTCTTCT101GAGATCACCACCAAGGATCTTAAGGAGAAGAAGGAGGTTGTTGAGGAGGC151TGAGAACATGACTAGAATGTCTGATGCTGCTGTTGATACCTCTTCTGAGA201TCACCACCAAGGATCTTAAGGAGAAGAAGGAGGTTGTTGAGGAGGCTGAG251AACATGACTAGAATGTCTGATGCTGCTGTTGATACCTCTTCTGAGATCAC301CACCAAGGATCTTAAGGAGAAGAAGGAGGTTGTTGAGGAGGCTGAGAACA351TGACTAGTTAAGAGCTC417<210>2〈211>131〈212>PRT〈213>4XTal蛋白〈400>2MSRMSDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAENMTRMSDAAVDTSSEITTK1DLKEKKEVVEEAENMTRMSDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAENMTRM51SDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAE丽TS13权利要求1.一种4连体胸腺素α1基因序列，其特征在于，包括根据植物偏爱密码子设计的编码具有生物活性胸腺素α1多肽的核苷酸序列；且核苷酸序列与SEQIDNO.2中从核苷酸第16-408位的核苷酸序列有至少75％的同源性；或者核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQIDNO.2中从核苷酸第16-408位的核苷酸序列杂交。2.根据权利要求l所述的4连体胸腺素cil基因序列，其特征是，所述的序列编码具有SEQIDN0.3所示的氨基酸序列的多肽。3.根据权利要求l所述的4连体胸腺素al基因序列，其特征是，所述的DNA分子，其所构建的载体包含该DNA分子。4.根据权利要求l所述的4连体胸腺素al基因序列，其特征是，所述的DNA分子，其所构建的载体转化的宿主细胞是植物或真核细胞。5、一种转基因番茄的制备方法，其特征在于，该方法包括如下的歩骤第一步、含目的基因(4XTal)表达载体的构建将含有4XTal基因的克隆载体质粒进行酶切，回收目标DNA片段，获得带有相应的粘性末端的目的基因4XTal，然后将其克隆到植物表达载体中，通过测序或酶切鉴定，在确保表达载体中的目的基因阅读框架正确的前提下，再将表达载体质粒用冻融法转入农杆菌中，获得包含目的基因表达载体的工程菌；第二步、植物遗传转化①将灭菌后的植物种子播于发苗培养基上，待子叶展开后，将子叶或下胚轴剪成小片作为外植体用于转化；②将含有目的基因表达载体的工程菌于28'C摇菌培养至0D6。。=0.81.0时，室温6，000g离心58min;③弃上清，菌体用液体MS培养基重悬，然后加入准备好的包括子叶和下胚轴在内的外植体浸泡810分钟；④将浸染结束后的外植体取出，吸去表面残余菌液；然后将外植体置于共培养培养基上在25。C共培养36小时；⑤共培养结束后将外植体转移到分化培养基上，在2S28。C光照下培养，3~4周可见形成抗性愈伤组织或再生芽；⑥待再生芽长至约3-4厘米时,将其切下移植到生根培养基上进行生根培养，710天左右生根；⑦根系发达后，将植株取出，用无菌水洗去附着在根系上的固体培养基，在珍珠岩中驯化并用质量体积百分比为P/。的MS粉水溶液补充营养和水分，一周后移入土中。6、根据权利要求5所述的转基因番茄的制备方法，其特征是，第二步中所述的发苗培养基的各组成成分的质量百分比为MS粉为0.22%，蔗糖为3%，植物凝胶为0.26%，余量为蒸馏水，该发苗培养基的pH值为5.8。7、根据权利要求5所述的转基因番茄的制备方法，其特征是，第二步中所述的液体MS培养基的各组成成分的质量百分比为MS粉为0.44%，蔗糖为3%，余量为蒸馏水，该液体MS培养基的pH值为5.8。8、根据权利要求5所述的转基因番茄的制备方法，其特征是，第二步中所述的共培养培养基的各组成成分的质量百分比为MS粉为0.44%，蔗糖为3%，植物凝胶为0.26%，6-苄氨基嘌呤为0.0002%，吲哚乙酸为0.00002%,余量为蒸馏水，该共培养培养基的PH值为5.8。9、根据权利要求5所述的转基因番茄的制备方法，其特征是，第二步中所述的分化培养基的各组成成分的质量百分比为MS粉为0.44%，蔗糖为3%，植物凝胶为0.26%，6-苄氨基嘌呤为0.0002%，吲哚乙酸为0.00002%，卡那霉素为0.005%,羧苄青霉素为0.025%，余量为蒸馏水，该分化培养基的pH值为5.8。10、根据权利要求5所述的转基因番茄的制备方法，其特征是，所述生根培养基的各组成成分的质量百分比为MS粉为O.44%，蔗糖为3%，植物凝胶为0.26%，6-苄氨基嘌呤为0.0002%，吲哚乙酸为0.00002%，卡那霉素为0.005%，羧苄青霉素为0.025%,余量为蒸馏水,该生根培养基的pH值为5.8。全文摘要一种4连体胸腺素α1基因序列及转基因番茄的制备方法，属于基因工程领域。本发明包括根据植物偏爱密码子设计的编码具有生物活性胸腺素α1多肽的核苷酸序列，而且核苷酸序列与SEQIDNO.2中从核苷酸第16-408位的核苷酸序列有至少75％的同源性；或者核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQIDNO.2中从核苷酸第16-408位的核苷酸序列杂交。本发明还提供了一种利用植物系统表达胸腺素α1功能蛋白的方法。本发明的4×Tα1基因在真核细胞中表达产品对提高人体的免疫力，对预防和治疗人类重大疾病如肝炎、爱滋病、癌症和糖尿病方面具有重要作用及应用价值。文档编号C12N15/16GK101451137SQ20081004166公开日2009年6月10日申请日期2008年8月14日优先权日2008年8月14日发明者冉张,昱张,宁杨,芦丽亚,赵凌侠申请人:上海交通大学