专利名称：一种番茄抗病毒蛋白基因的克隆的制作方法
技术领域：
抗病毒蛋白是植物细胞中的一种重要的免疫组分，其重要作用就是拮抗植物感染病毒的侵染，从植物组织和细胞中分离的抗病毒蛋白对于研发生物农药具有重要意义。本发明通过改进的DNA克隆技术和基因重组技术，将一种番茄抗病毒蛋白基因从野生秘鲁番茄叶片中分离出来，其技术发明属于生物农药合成工程技术领域。
背景技术：
抗病毒蛋白是植物细胞中的一种重要的免疫组分，其重要作用就是拮抗植物感染病毒的侵染，从植物组织和细胞中分离的抗病毒蛋白对于研发生物农药具有重要意义。利用植物组织中已经合成的生物蛋白实现生物农药生产是现代农药应用与生物防治研究的重要研究课题。栽培植物及其农作物具有完备的防卫系统，能够抵御来自于微生物的侵染和危害。植物个体自身的生化反应过程产生了许多拮抗病原菌的化合物一一各种蛋白、多肽、酯类、酚类的生化小分子，这些生化物质构成了植物的防卫反应系统。来自于植物自身的合成产物通常对人类和植物本身是没有危害的，也不会对人体产生负面的影响，是环境友好型的环保产品。因此，植物化合物生产是生物防治和药物生产的重要产业。自从1986年诞生第一株抗病毒工程植株以来，植物抗病毒基因工程研究不论在深度上还是广度上都取得了很大的发展。来自于番茄的斑萎病毒抗性基因你-7/7能够在植物组织内获得植物免疫系统的启动和抗性形状的表达，有助于植物自身免疫系统的激发和对斑萎病毒的抗病性。番茄的你-7/7基因位于第9号染色体上，与分子标记CT 220有 2. OcM，西班牙的科学家已经将番茄的两个BAC ( C09HBa0226D21和C09HBa0109Dll )测序，比对已经发表的Sw-5a和Sw-5b基因序列，我们利用野生的秘鲁番茄克隆了 Sw-Ip基因，该基因能够拮抗番茄斑萎病毒两个毒株(TSWV-A和TSWV-D)的侵染。Sw-Ip基因全长为 3738p，编码有1245氨基酸，是一个属于CC-NBS-LRR类型的抗病毒蛋白。
发明内容
本研究采用植物中存在的抗病毒蛋白基因进行重组抗病毒基因的克隆技术方法。 这种抗病毒蛋白对自身基因转录与蛋白的合成不起破坏作用，但能特异失活与其基因互作的病毒蛋白，抑制病毒蛋白质的合成，使得浸染的病毒不能完成正常的侵染过程。大量的研究结果表明，植物体中的抗病毒蛋白具有专化型的病毒蛋白抑制作用。抗斑萎病毒蛋白基因是一种从中野生的秘鲁番茄仏叶片中分离提取的基因，其编码蛋白是一种具有抗斑萎病毒侵染特性的抗病毒蛋白。本发明的目的是通过基因克隆技术和基因重组技术，从植物叶片中分离和克隆抗病毒蛋白，并且在原核中生物体中表达具有抗病毒特性的蛋白，实现有利于环境和人类健康的生物制剂和生物农药的应用。本发明应用DNA重组技术和分子生物学方法，从野生番茄叶片中分离了一个长度为3738bp的抗斑萎病毒蛋白的基因你-尔，并在大肠杆菌中表达了这段目的基因。本发明的是由以下技术方案实现的，1)从植物DNA中分离了一种抗斑萎病毒蛋白基因；2)在大肠杆菌中重组和表达了该基因。该基因片断的核苷酸序列为SEQ NO. 1所示的长度从ATG到TGA为3738bp。该抗斑萎病毒蛋白的氨基酸序列为SEQ NO. 2所示的长度 1245个氨基酸。所述的长度为3738bp的抗病毒蛋白基因你-尔，其插入到克隆载体pMD_18中时， 获得了含有你基因扩增片断的重组DNA质粒pMD-18 Qp)0质粒pMD_18 (尔 )包含有长度为3738bp的抗病毒蛋白基因你-尔。该质粒经转化大肠杆菌(五cWi) DH5 α获得克隆菌株pMD/5k-T/7，该菌株经过培养能够表达1245个氨基酸的抗斑萎病毒的蛋白，其菌种将在近期获得并补充保藏号。本发明的技术特点一是从野生秘鲁番茄叶片的DNA中分离出了抗病毒基因；二是所分离的抗病毒蛋白基因能够通过大肠杆菌表达；三是该基因克隆的方法是与基因重组技术相结合；四是该基因经过重组可以获得生物农药。本发明所述的抗病毒蛋白基因Sw-Ip具有如下结构特点1)基因长度为3738bp ； 2)具有CC-NBS-LRR蛋白特征；3)拥有多个磷酸化位点；4)具有ATP/GTP结合位点的基序 A (P-Ioop) ； 5)对番茄斑萎病毒(TSWV)具有抗性。本发明所获得的的抗病毒蛋白基因5^-7/7，具有拮抗植物感染病毒的侵染的功能， 对于研发生物农药具有重要意义。该基因经过重组可以获得生物农药。本发明所获得的克隆菌株pMD/5k-T/7，经过培养能够表达抗病毒的蛋白，可作为抗植物病毒活性组分用于生产生物农药。上述生物农药可用于防治多种植物病害。因此，以该基因保守序列为模版合成的或分离的其它植物蛋白，如果其基因结构与SEQ NO. 1的所述的核苷酸序列，则在具有专业知识的工程技术人员的操作下，经过一定的和部分的核苷酸序列的修饰(突变、缺失、替代、剪贴、重复、倒位、易位、转座、重组和拼接)以及一个或数个碱基(氨基酸)的改变，可以获得同类基因，并不能够显著地影响抗病毒蛋白的功能。使用经过核苷酸序列的修饰以及一个或数个碱基改变的抗病毒蛋白基因， 并且具有与SEQ NO. 1的核苷酸序列70%以上相似序列都属于本专利的发明内容和保护范围。
具体实施例方式本发明以几种重要的茄科病毒抗性基因的DNA序列设计扩增引物，对野生的秘鲁番茄基因组DNA进行扩增，获得了一个抗病毒相关的基因。
具体实施方式
如下
1)采用Primer Premier 5. O软件设计N对引物。2)野生番茄DNA的提取采用CTAB法提取，实施PCR基因扩增技术获得目标序列。 PCR 程序为 95°C 10 min ；95°C 30 S，53°C 30 S，72°C 2.5 min，42 个循环；72°C 延伸 10
mirio3) 0 产物回收后克隆至载体？1 _18中。双向测序验证并获得了长度为3738bp 的DNA扩增片断。4)采用Trizal法提取野生番茄叶片的总RNA，DNase I处理纯化后，用UNT0-10柱式mRNA抽提试剂盒获得mRNA，随后用MMLV第一链cDNA合成试剂盒获得反转录的cDNA，并利用CA Adaptor建立cDNA文库，再以相同的引物实施PCR扩增。PCR产物回收后克隆到载体pMD-18中，双向测序验证已经克隆的长度为3738bp的基因产物。5)利用DNAMAN 5. 0进行野生番茄同源基因的核苷酸序列序列比对和验证，利用 NCBI网站的⑶-Search服务来分析核苷酸序列的特异性。
SEQ NO. 1抗斑萎病毒蛋白基因的核苷酸序列序列表SEQ NO. 1 <110>姜国勇
<120> 一种抗斑萎病毒蛋白基因的克隆
<140>专利申请号
<141> 2010 -12-28
<170> Patent In Version 2. 1
<210> 1
<211> 3738
<212> DNA
<213> pMD-18/Sw-lp <220>
<221> misc_feature <222> (1)... (3738) <223> η =a 或 g 或 c 或 t <220>
<221> gene <222> (1)... (3738) <311> protein <312> 1-1245 <400> (1)... (3738)
ATGGCTGAM ATGAAATTGA GGMATGTTA GAGCACCTGA GAAGGATCAA GAGTGGAGGT60
GATCTGGATT GGTTCGACAT ATTGCGMTT GAGGAACTTG AAATGGTGCT AAGAGTTTTT 120 AGAACCTTTA CAAAGTATCA TGATGTTCTT TTGCCTGATT CCTTAGTCAA ACTCACAAAG 180 ATGGCCAAAT TGACTGGGGA AATACTTCAC CGGGTGTTGG GTAGGATTCC ACATAAATGT 240 MAACTAACC TTAATCTAGA AAGGCTAGAA TCACATTTGT TGGAATTCTT TCMGGTMT 300 ACGGCCAGTT TAAGTCGCAA TTATGAGTTG AATGATTTTG ATCTGTCMA ATATATGGAT 360 TGTCTGGAM AATTTCTMA TGATGTACTG ATGATGTTCT TGCAAAAGGG TAGGTCCTGC 420 CATTCCAMA GMAACTTGC AATACATCGA TCTATMAGG AACTGAAAAT TGTTCAAAAG 480 AMATGAGAT TTTTGMATA CATATATGCC ACAGAGATAA ATGGTTATGT CGACTATGAG540
AAGCAGGAAT GTTTGGAGAT TCGAATTCAG TTCATGACTA ACACTGTGGG ACAATATTGT 600 GTGGCCGTAT TAGATTATGT CGCTGAGGGT GAACTTAATG ATGAMATGA CAACTTTAGT 660 MACCTCCTT ACCTATTATC ATTGATTGTG TTTGTGGAGC TGGMATGM GAAGCTTTTT 720CATGGTGAAG TAMGGCTTC AAAGTTTACT CGATCAMAA CTTTCMGGA CAAGAMTTA780
CCMAAGGAT TTTCACATCA TCTCCACAAT CTGTTGATGT ATCTCAGAAA CAAAMGCTC840
GAGAATTTTC CTAATMTAT CGCTGCTCAA AATATCGATG TGGCAATAGA GTTCTTGTTG900
GTTTTCCTTG ATGCTGATGT GTCAMTCAT GTTATTAATG GTMCTGGTT GAMGAGGTC960
TTGTTAAAGG TTGGAGCTAT AGCGGGTGAT ATTCTATATG TMTTCMAA GCTTCTTCCT1020
AGATCAATM ACAMGATGA AACTAGCAAC ATMGTCTTT GCTCAATACA GATATTGGAG1080
AAGACTAAAG ATCTGAAGGC ACAAGTTGAG ACGTACTACA MTCCTTAAA ATTTACTCCA1140
TCTCAGTTCC CCACCTTTGG TGGATTGAGC TTTCTGGATT CTCTTTTAAG GAAACTGAAT1200
GAGATGTCGA CATCTMGTC CGGATTAGGT TTCCTGACGA AACCTCTTTT AGGGAATTTG1260
GAGAAAGAGC TATCATCTCT TGCATCCATT TTAGAGAAGG AGCTCTCATC CATTTTCAGT1320
GATGTCGTGC ACCATGAACA TAACATTCCT AAAGATCTTC AGAGACGTAC CATCAATTTG1380
GCATGTGAGG CTGAGGTTGC TATTGATTCT ATTCTTGCTC AGTATAATGT TTTTTTGCAT1440
ATTTTTTGCT CACTTCCTAC AATTGTAAM GAGATCAAGC AAATTAATGC AGAGGTGACT1500
GAGATGTGGT CAGCGGACAT TCCTCTTMT CCTCATTATG TGGCTGCTCC ATTAAMCAT1560
CTGCCGGATC GACATAGCAA TCTTGTMCT GATGAGGAGG TAGTGGGTTT TGAGMTAAA1620
GCAGAAGAAC TMTTGATTA TCTGATTAGA GGTACAAATG AGCTAGACGT TGTCCCAATT1 680
GTAGGCATGG GAGGACAAGG GMAACGACA ATTGCTAGAA AGTTGTACAA TAATGACATT1720
ATTGTTTCTC GCTTTGATGT TCGAGCATGG TGCATCATTT CTCAMCGTA TAATCAGAGA1800
GAGTTATTAC MGATATTTT TAGTCMGTT ACAGGTTTCA ACGACAATGG AGCTACGGTT1860
GACGTTCTTG CCGACATGTT GAGGAGAAAA TTAATGGGM AGAGATATCT CATTGTATTG1920
GATGATATGT GGGATTGTAT GGTATGGGAT GACTTAAGGC TTTCTTTTCC AGATGTTGGA1980
ATTAGAAGCA GAATAGTCGT AACAA CTCGA CTTGAAGAAG TGGGTAAGCA AGTCAAGTAC2040
CATACTGATC CTTATTCTCT TCCATTCCTC ACMCAGMG AGAGTTGCCA ATTGTTGCAG2100
AAAMAGTGT TTCAAAAGGA AGATTGCCCG CCTGAACTAC AAGATGTGAG TCAAGCAGTA2160
GCAGAAAMT GCAAAGGACT GCCCCTAGTG GTTGTCTTGG TAGCTGGAAT AATCMAAAA2220
AGGAAAATGG MGAATCTTG GTGGAATGAG GTGAMGATG CTTTATTTGA CTATCTTGAC2280
AGTGAGTTCG AAGAATATAG TCTGGCAACT ATGCAGTTGA GTTTTGATM CTTACCCCAC2340
TGTTTAAAGC CTTGTCTTCT TTATATGGGA ATGTTTTCGG AGGACGCAAG AATTCCAGCA2400
TCTACATTGA TAAGTTTATG GATTGCTGAA GGATTCGTGG AGAACACTGA ATCTGGTACA2460
TTAATGGAAG AGGAAGCTGA AGGTTACTTG ATGGATCTCA TTAGCAGTAA CATGGTAATG2520
CTTTCAAAGA GAAGTTATM GGGTAAAGTC AAATACTGTC AGGTTCATGA TGTTGTGCAT2580
CACTTTTGCT TGGAAAAGAG TAGAGAAGCA AAGTTTATGC TTGCAGTGAA GGGTCMTAT2640
ATCCAGTTTC AACCTTTGGA TTGGAAGGGA ACTCGAGTGA GCTTCAGTTT TAGTGAAGAG2700
CTTTCCAAGT TTGCATCTCT GGTCTCCMA ACACAGMGC CTTTCCATCA ACACTTGAGG2760
TCATTGATAA CGACCAATCG AGCAGAATCT ATTGATGTGA TTCTCTTCTG TCAGATTAGT2820
GMTTGCGAC TTCTTMAGT CTTGGATTTG AGTTCTTATA CTGTGGAATT TTTGTCGTTA2880
GCTACATTCA AACCACTAAA TCAGCTGAAG TACCTCGCAG TTCAGGCTGA TAMTTCTAT2940
TTTGATCCAG GATCACATCT TCCCCATATA GAMCTTTCA TTGTMAGAA TTTTCCTTAT3000 GGTATAGGGT TACCAGTGTC TTTTTGGGAA ATGAMAAAT TAAGGCATGC TCATTTTGGT3060
权利要求
1.一种克隆获得的番茄抗病毒蛋白基因5^-7/7，其特征在于所述的抗病毒蛋白基因的核苷酸序列为SEQ NO. 1所示的3738bp。
2.一种含有权利要求1所述的番茄抗病毒蛋白基因的重组质粒，并在大肠杆菌 (M. coli)\m α获得克隆菌株pMD/5k-T/7，该菌株含有克隆获得的抗病毒蛋白基因Sw-Ip， 该菌株已送中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏。
3.如权利要求1所述的番茄抗病毒蛋白基因你-尔，其具有CC-NBS-LRR蛋白特征；具有如下结构特点1)基因长度为3738bp ；2)拥有多个磷酸化位点；3)具有ATP/GTP结合位点的基序A (P-Ioop )。
4.如权利要求1所述的番茄抗病毒蛋白基因的克隆技术和方法，其特征在于1)引物设计；2)载体克隆；3)反转录的cDNA验证；4)同源基因的核苷酸序列序列比对和验证。
5.如权利要求1所述的番茄抗病毒蛋白基因的应用，其特征在于该基因经过重组可以获得生物农药。
6.如权利要求2所述的克隆菌株pMD/5k-T/7的应用，其特征在于经过培养能够表达抗病毒的蛋白，可作为抗植物病毒活性组分用于生产生物农药。
7.如权利要求5、6所述的生物农药的应用，其特征在于用于防治多种植物病害。
全文摘要
本发明属于生物农药合成工程技术领域，具体地说是通过基因克隆技术和基因重组技术，从植物叶片中分离和克隆抗病毒蛋白基因Sw-lp，并且在原核生物体中表达具有抗病毒特性的蛋白。抗病毒蛋白基因Sw-lp具有如下结构特点1)具有CC-NBS-LRR蛋白特征；2)拥有多个磷酸化位点；3)具有ATP/GTP结合位点的基序A(P-loop)。可作为抗植物病毒活性组分生产生物农药，用于防治多种植物病害。
文档编号C12N15/63GK102154310SQ201010613670
公开日2011年8月17日 申请日期2010年12月30日 优先权日2010年12月30日
发明者姜国勇 申请人:姜国勇