重组蓝藻抗病毒蛋白的制备方法及应用的制作方法

专利名称：：重组蓝藻抗病毒蛋白的制备方法及应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及基因工程
技术领域：
,具体涉及一种重组蓝藻抗病毒蛋白的制备方法，以及此方法中涉及的表达载体和寄主细胞，本发明还涉及所述表达载体和/或寄主细胞和/或所述方法得到的重组蓝藻抗病毒蛋白在制备抗病毒药物中的应用。
背景技术：
：蓝藻抗病毒蛋白N(CVN)是一种从蓝藻，又名蓝细菌Cyanobacteria(Nost.ocettipsosporum)中分离得到的一种水溶性糖蛋白，其独特的抗病毒活性最初是在一项抗人类免疫缺陷病毒(humani細翻defiiciencyvirus,:H]:V)天然药物筛选计划中发现的[BoydMR,GustafsonKR，McMahonJB，etal.Discoveryofcyanovirin_N，anovelhumani咖皿odefiiciencyvirus—inactivatingproteinthatbindsviralsurfaceenvelopeglycoproteingpl20-potentialapplicationstomicrobicidedevel邻醒t[J].Antimicrob.AgentsChemother,1997,41(7):1521—1530.]。后来的研究表明其具有广泛的抗病毒作用。天然CVN相对分子质量为llkD，一级结构含有101个氨基酸残基，无翻译后的修饰，带有两个内部二硫键。CVN能特异地、高亲合性地结合在人免疫缺陷病毒HIV-1的衣壳蛋白gpl20上有效降低IIIV-l病毒对细胞的感染[BewleyCA,GustafsonKR，BoydMR,etal.Solutionstructureofcyanovirin—N，apotentHIV—inactivatingprotein[J].NatStructBiol，1998，5(7):571.]。此外CVN对流感病毒、埃博拉病毒、疱疹病毒.和黄-热病病毒、副、克感病毒.、丙型月干炎病毒.AntimicrobAgentsChemother,2003，47(8):2518.,BarrientosLG，0'KeefeBR,BrayM，etal.Cyanovirin_Nbindstotheviralsurfaceglycoproteingpl，2andinhibitsinfectivityoftheEbolavirus[J].AntiviralResearch,2002，58(1):47256.]等都有诘抗作用。早在CVN发现之初，CVN的重组表达研究就已经开始，目前已在大肠杆菌,酵母菌和植物细胞中表达成功,但这些重组表达方法存在表达产量低，易形成包涵体且复性困难，易形成无活性的二聚体形式，融合表达出现氨基酸缺失，纯化方法复杂等缺点[MoriT，GustafsonKR，ParmellU(，etal.Recombinant,productionofcyanovirin—N,apotenthumanimmunodefiiciencyvirus—inactivatingproteinderivedfromaculturedcyanobacterium[J].Protein:ExprPurif，1998，12(2):151.，MoriT，BarrientosLG，HanZ，etal.Functionalhomologsofcyanovirin_Namenabletomassproductioninprokaryoticandeukaryotichosts[J].ProteinExprPurif,2002,26(1):42.，ColleluoriDM，TienD，KangF,etal.Expression,purifiication，andcharacterizationofrecombinantcyanovi—rin—Nforvaginalanti-HIVmicrobicidedevelopment[J].ProteinExprPurif，2005,39(2):229.，SextonA,DrakePM，MahmoodN,etal.TransgenicplantproductionofCyanovirin—N，anHIVmicrobicide[J].FASEBJ，2006,20(2):356.]。3小分子泛素样修饰蛋白(Smallubiquitin-likemodifiier，SUMO)，和泛素具有类似生物学功能，广泛存在于真核细胞中。发挥着调节蛋白质之间的相互的作用(SUMO化和去SUMO化)，调节蛋白在核质间的运输，帮助蛋白质在细胞内正确的定位，调节蛋白质的转录活性以及抗泛素化等作用[Zhou,F.F.Xue,Y.andLu，H.Letal.Agenome-wideanalysisofsumoylation—relatedbiologicalprocessesandfunctionsinhumannucleus[J]FEBSLett,2005，579:3369.，，Johnson,E.S.ProteinmodifiicationbySUMO[J]A画.Rev.Biochem,2004，73:355.]。SUMO蛋白融合表达系统是一种有效地表达小分子量蛋白的表达方法，具有抗蛋白酶解，增加重组蛋白表达量，促进蛋白正确折叠，能准确无误地切除融合标签，纯化工艺简单等优点。
发明内容为克服上述现有技术中存在的问题及不足，本发明的目的首先在于提供一种高效表达活性重组蓝藻抗病毒蛋白N(CVN)的表达载体。本发明的另一目的是提供携带或整合了上述表达载体的寄主细胞。本发明的再一目的是提供一种利用上述寄主细胞高效表达重组CVN的方法。本发明的再一目的是提供一种具有抗病毒活性的重组CVN。本发明的最后目的是将上述表达载体和/或寄主细胞和Z或上述重组CVN用于制备抗病毒的药物。为实现上述目的，本发明的技术方案如下本发明首先基于S[M()蛋白融合表达系统,构建了包含编码蓝藻抗病毒蛋白N的核苷酸序列的表达载体，所述核苷酸序列编码的蛋白包含SEQIDNO:l和SEQIDNO:2的氨基酸序列。本发明进一步提供了包含该表达载体的寄主细胞，同过培养该细胞，并结合现有的分子生物学技术对目标蛋白进行了分离纯化，得到了高纯度的重组CVN。本发明进-步用实验证明了纯化后的重组CVN的抗病毒活性，充分证明上述表达载体和/或寄主细胞和/或得到的重组蛋白能够应用于制备抗病毒的药物。作为优选方案，我们的表达载体选择包含SEQIDN0:3的核苷酸序列，选择的载体骨架是P:ET3c并优选大肠杆菌作为表达载体的宿主。具体步骤是根据大肠杆菌密码子偏好性对CVN原始核苷酸序列进行优化，通过多次PCR合成SUM0-CVN的全长序列，构建pET3c-SUM0-CVN重组表达质粒，转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株中表达SUM0-CVN融合蛋白，然后用特异性的SUMO蛋白酶对融合蛋白进行酶切，并再次通过Ni柱纯化除去含6XHis标签的SUM()，SUMO融合蛋白和SUMO蛋白酶，得到纯化的重组CVN蛋白。本发明的有益效果如下(1)提高了CVN在宿主菌中的表达水平。将CVN与分子伴侣蛋白SUMO融合，促进CVN在大肠杆菌中的表达,最终获得表达量40%的工程寄主菌株；(2)改变了CVN高表达的表达形式，不再形成包涵体；(3)通过His标签的巧妙应用，简化了下游纯化路线，并且不需要His标签特异性蛋白酶就可最终制备不带标签的CVN，得到的纯化后的重组CVN在最大程度上保留了天然CVN的结构特征,表现为重组CVN蛋白的肽质量指纹谱与理论肽质量指纹谱完全一致。图1是PCR合成SUMO-CVN全长序列方案。其中，M:DL2000DNAmarker,1:F卜CVN、R卜CVNPCR产物；2:F2-CVN、R2-CVNPCR产物；3:F3-CVN、R3-CVNPCR产物4:F4-CVN、R4-CVNPCR产物5:F4-CVN、R5-CVNPCR产物；6:F-SUMO、R-SUMOPCR产物;7:SUMO-CVN全长序列。图3是PET3c-SUMO-CVN质粒的图谱。图4是重组质粒pET3c-SUM0-CVN的双酶切鉴定结果。其中M:DL2000DNAmarker;1:双酶切鉴定；2:PCR鉴定。图5是SUMO-CVN融合蛋白表达条件的优化。其中M:lowmolecularproteinmarker;1，2，3分别是0.5慮]:PTG在37。C、3(TC、20。C诱导4h;4是O.5mMIPTG20。C诱导24h;5，6，7分别是lmMIPTG在37°C、30°C、20。C诱导4h;8:lmMIPTG2(TC诱导24h。图6是重组CVN蛋白纯化结果的SDS-PAGE鉴定图谱。其中:M是lowmolecularproteinmarker;1:上清;2:穿透峰;3:4()mM咪唑洗脱峰;4:200mM咪唑洗脱峰;5:酶切;6:酶切后200fflM咪唑洗脱峰;7:CVN。图7是重组CV-N蛋白的肽质量指纹谱(PMF)，"I"表示于理论肽谱相符的肽质量。图8是MALDI-TOF测定重组CV-N蛋白分子量。其中(A)包含Tl和T7肽段;(B)包含T2,T3，T4，T5,T7和T8月太段。图9是MTT法测定CVN，SUMO—CVN蛋白抗HSV-I活性。图10是MTT法测定CVN，SUMO—CVN蛋白对Vero细胞毒性。图11是CVN对HIV-1/11IB致细胞病变效应的抑制活性。图12是CVN对宿主细胞生长的抑制活性(毒性)。图13是CVN抗HIV-1ZIIIB活性测定过程中的宿主细胞形态。具体实施例方式本发明实施例涉及的主要材料如下宿主菌BL21(DE3)、质粒pET3c由本室保存；质粒pET3c-SUM0和SUMO蛋白酶由暨南大学医药生物技术研究开发中心黄亚东博士惠赠，Taq酶、T4连接酶限制性内切酶NdeI、Bamhl购自大连宝生物公司，IPTG、小相对分子质量标准蛋白、引物购自上海生工生物公司；NiS印haroseTM6FastFlow购自Amersham公司，四甲基偶氮唑(MTT)，美国SIGMA公司；单纯疱疹病毒1型(HSV-l)F，武汉大学病毒研究所；Vero细胞，美国ATCC公司。其它试剂均为分析纯试剂。NTA-lObuffer(20mmolZLTris-HCl，pH8.O，O.5mol/LNaCl，10咖ol/L咪唑)，NTA_40buffer(20咖ol/LTris-HCl，pH8.0，0.5mol/LNaCl，40咖ol/L咪唑)，NTA-200buffer(20mmol/LTris-HCl，pH8.0,0.5mol/LNaC:[,2()0ramo:[/:[.,咪唑)，酶切缓冲液(2()mniol/LTris-HCl，p:H8.0,2%]:g印a:[,1.5rao1/LNaCl，IO翻IZLDTT)。实施例1达质粒pET3c-SUM0-CVN的构建及序列分析1、引物序列的设计5根据大肠杆菌密码子偏好性，对CVN原始序列进行优化，合成十一条引物,通过多次PCR合成SUMO-CVN的全序列，合成策略如图1所示。所设计的引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，序列见表l。表1用于合成SUMO-CVN全长序列的弓I物引物名称序列F4-CVNCAGAGAACAGATTGGTGGTCTTGGTAAATTCTCCCAGACF3-CVNCTGGGTAAATTCTCCCAGACCTGCTACAACTCCGCTATCCAGGGTTCTGF2-CVNCTCCGCTATCCAGGGTTCTGTTCTGACCTCTACCTGCGAACGTACCAACGGTGGFl-CVNCGAACGTACCAACGGTGGTTACAACACCTCCTCTATCGACCTGAACTCCGTTATCGRl-CVNGAAGTTAGACGGCTGCCATTTCAGAGAACCGTCAACGTTTTCGATAACGGAGTTCAGGTR2-CVNCAGAGGAACCAGCCAGCTGGGTGTTACGGCAGGTTTCGATGAAGTTAGACGGCTGCCR3-CVNCGAACTGCTGAGCACGGGTTTTGCATTCAGCAGCCAGTTCAGAGGAACCAGCCAGCTR4-CVNGTTAGCGATGTGGTCGTCCAGGTTGATTTTGGTAGAAACGAACTGCTGAGCACGGGTR5-CVNAGAGGATCCTCATCATTCGTATTTCAGGGTACCGTCGATGTTAGCGATGTGGTCGTCF-SUMOCAGCATATGCATCATCATCATCR-SUMOCTGGGAGAATTTACCAAGACCACCAATCTGTTCTCTG2、PCR合成SUMO-CVN全序列合成分两步进行，首先通过多次PCR合成CVN基因，第一次PCR引物是Fl-CVN、R卜CVN。反应体系为引物各1ii1，8y1无菌ddH20，10y1TaqPCRMast.erMix,反应混合物9化变性lmin，退火至55°C，保持lmin，72t:延伸lmin，进行29个循环。反应产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，并做胶回收，作为下一轮PCR的模板，经过5次PCR反应合成全长的CVN序列。SUMO全长序列通过PCR方法从PET3c-SUMO中合成。利用SUMO序列末端与CVN序列前端的20bp重叠互补序列进行PCR:以SUMO序列和CVN序列为延伸模板，F卜SUMO,R5-CVN为上下游引物，在常规的PCR条件下进行反应，反应产物进行1%琼脂糖凝胶电泳(图2)，6并做胶回收，得到SUM0-CVN全长序列。3、表达质粒构建及序列分析如图3所示，将质粒pET3c和SUM0-CVN全长序列分别用NdeI与BamIII进行双酶切，酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，回收酶切产物，用T4DNA连接酶把这两个酶切产物连接起来，构建成重组质粒pET3c-SUM0-CVN。重组质粒转化大肠杆菌JM109感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素的LB平板上，37t:培养过夜，提取质粒进行PCR及NdeI与BamHI双酶切鉴定(图4),并送往英骏公司测序。1、表达菌株的筛选及诱导表达挑取经测序正确的单克隆，抽提质粒转化到表达宿主BL21(DE3)中，用含氨苄青霉素的平板筛选出阳性转化子，挑取单克隆到3ml含氨苄的LB培养基中，37°C,180rpm培养至()D6。。=0.61.0。取lml作未诱导对照，其余加:I:PTG至终浓度lramo:l/L，在37。C下诱导4h，离心收集菌体，菌体沉淀重悬于100u1ddH20中，并加入1u1溶菌酶，室温孵育30min。4。C，20000Xg离心15min，分别取....匕清和沉淀，进行12%的SDS-PAGE分析。选择有表达产物的单克隆进行菌种保存。2、SUMO-CVN融合蛋白表达条件分析将保存的菌种按1%接种于3mlLB培养基，37°C、180，振荡培养过夜，1%的接种量接种到50ml含氨苄青霉素(100mg/L)的LB培养基中，至0D6。。到0.6时，把培养基分成4瓶，3瓶分别在37°C、30°C、20°C0.5mMIPTG诱导表达4h;另外1瓶在20°C、0.5mMIPTG诱导表达24h。用同样的方法，在1.OmM]:PTG条件下诱导表达。4°C、6000Xg、l()min离心收集菌体。菌体沉淀溶解在5mlNTA-10buffer(20咖olZLTris-HCl，pH8.0，0.5mol/LNaCl，10咖ol/L咪唑)中，冻融3次，超声破碎3次。破碎产物4°C、25000Xg、30min离心，收集上清和沉淀，进行SDS-PAGE电泳分析，并进行灰度扫描，确定各表达条件下可溶性目的蛋白表达量，确定最佳表达条件。结果如下:SDS-PAGE电泳分析(图5)可见重组菌体会表达大小约为29kDa的融合蛋白，且融合蛋白多数位于上清中，为可溶性表达(图5，l匿l)。可溶性融合蛋白表达情况如(表2)所示。由表2可知最佳表达条件是IPTG终浓度为0.5mmol/L,2(TC，诱导表达24h。表2不同表达条件下可溶性蛋白含量<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>3、SUM0-CVN融合蛋白摇瓶发酵及纯化选取高表达菌株接种到1L含氨苄青霉素(100mg/L)的LB培养基中，按前述最佳表达条件进行摇瓶发酵并诱导。4。C、6000Xg、10min离心收集菌体,冻融一次，然后将菌体沉淀以1:10比例重新悬浮于NTA-l()buffer，超声破碎(工作时间5s、间歇时间5s，99次，重复3遍)，4°C、25000Xg、30min离心收集上清。上清液上样至柱床体积为20ml的Ni-NTA亲和层析柱中，流速0.6ml/min，NTA-10buffer洗回基线，流速为Iml/min,NTA-40buffer洗杂蛋白，NTA-200buffer，洗脱目的蛋白。纯化后的目的蛋白经S印hadexG-25分子筛脱咪唑后进行SUMO蛋白酶酶切，除去SUMO融合蛋白。结果如下1L的发酵培养基摇床发酵后收集得到6±0.5g菌体，菌体破碎产物用Ni-NTA亲和层析柱进行纯化，不含6xllis标签的杂蛋白40翻1/L咪唑的NTA-40缓冲液洗脱，StMO-CVN目的蛋白用含2()()mraol/L咪唑的NTA-200缓冲液洗脱。1L发酵产物约可以纯化得到44.6±lmg融合蛋白，占菌体总蛋白的20.2%。纯化产物经SDS-PAGE电泳后进行灰度扫描，结果显示纯度达90%(图6)。4、SUMO-CVN融合蛋白酶切、CVN蛋白纯化及鉴定纯化后的目的蛋白调整浓度至l呢/ml，加入1USUMO蛋白酶/mg融合蛋白，在酶切缓冲液中，30t:酶切lh。因SUMO、SUM0蛋白酶均含有6XHis标签，酶切后的样品按前述的纯化方法除去SUMO、未酶切的SUMO-CVN和SUMO蛋白酶后得到目的蛋白CVN。纯化后的CVN蛋白用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)进行肽质量指纹谱(peptidemassfiingerprinting,PMF)鉴定并须lj定分子量。结果如下纯化后的目的蛋白经S印hadexG_25分子筛脱咪唑后进行SUMO蛋白酶酶切，除去SUMO融合蛋白。酶切产物的SDS-PAGE电泳分析(图6)表明，30°C，lh条件卜一80%的融合蛋白可以被酶切开。酶产物再次用Ni-NTA亲和层析柱进行纯化得到目的蛋白CVN，SDS-PAGE电泳分析(图6)表明纯化的CVN蛋白纯度可达95%。l丄的发酵产物最终可纯化得到11±0.3mg的CVN蛋白。CVN蛋白一级结构的完整对其发挥抗病毒活性是至关重要的，研究发现N端和C端缺失能够造成CVN活性的下降，下降比例随着缺失残基的增加而提高.AntimicrobAgentsChemother,2003，47(8):2518.]。为鉴定重组蛋白是否是CVN蛋白、有无氨基酸缺失，纯化后的重组蛋白脱盐后用基质辅助激光解吸./电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)进行肽质量指纹谱(p印tidemassfiingerprinting，:PMF)鉴定并测定分子量，结果如图7、图8所示。其中从图7(A)上可以找到Tl和T7肽段，从图7(B)上可以找到T2，T3，T4，T5，T7,T8肽段，测定结果与胰蛋白酶酶切后理论肽谱相符(表3)。重组蛋白分子量测定结果为11019.87Da(图8)，与天然CVN蛋白理论分子量11013.16Da相差0.005KD,在误差范围内，说明所获得的重组蛋白为完整的CVN蛋白，无末端氨基酸缺失。表3:胰蛋白酶切后理论肽谱<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>购自JRHBioscience(LotNo.:6D0974)2、方法WST-1法(1)抑制率测定在P3生物安全柜中，重组CVN用含10%FBS的RPMI1640培养液稀释至50ug/mL(4.53ymol/L)、10ug/mL(0.91iimol/L)、2yg/mL(180翻1/L)禾口0.4iig,ZmL(36翻1/L)，共4个浓度梯度；收集培养至对数生长期的MT_4细胞，计数细胞总数和活细胞数，用含10%FBS的RPMI1640培养液调整细胞浓度至1X105cell/mL;取100iiL细胞悬液至96孔板中，加入1()()TCI:D50的HIV-l/IIIB病毒(50uL/孔)，再加入预先稀释好的不同浓度CVN样品(50yL/孔)，每个样品平行设置4个复孔，同时设空白对照、细胞对照、病毒对照和阳性对照(AZT，63nmol/L)各4个复孔;37°C，5%C02培养箱中培养96h后，加入10yL/孔WST-1(5mmol/L)溶液，37"C孵育4h，450nm测定吸光值。(2)毒性测定与抑制率测定方法相同，但各培养板孔中只加细胞和待测样品，不加病毒。(3)计算公式抑制率(IR)=(As-Av)/(Ac-Av)As:样品吸光值均值；[,]Av:病毒对照组吸光值均值；Ac:细胞对照组吸光值均值；3、结果如图11-13所示，CVN具有明显的抑制IIIV-1/IIIB活性，在浓度为10iig/'mL(().91iiraol/L)时，抑制率为73%,细胞密度为无病毒细胞对照组的95%,与阳性药物AZT的抑制率和毒性相当(74%，101%)，为高效低毒抗病毒物质。综上所述，本发明构建了pET3c-SUM0-CVN重组表达质粒，在大肠杆菌BL21(DE3)中表达成功。SUMO-CVN融合蛋白经Ni-NTA亲和层析柱纯化后，用S印hadexG-25分子筛脱去咪唑，以特异性的SUMO蛋白酶酶切即可除去融合标签。因SUMO-CVN融合蛋白N端，SIM)蛋白酶N端均含有6xHis标签，因此可以用Ni-NTA亲和层析柱方便地除去酶切后混合物中的杂蛋白，得到纯度达95%的重组CV-N蛋白，纯化后的重组蛋白脱盐后经肽质量指纹谱(PMF)鉴定和分子量测定表明其与野生型蛋白完全相同。抗病毒活性测定的结果表明重组蛋白CVN具有良好的抗HSV-I:型病毒活性，未酶切过的StM()-CVN融合蛋白同样具有较好的抗HSV-I型病毒活性；重组蛋白CVN也具有明显的抑制HIV-1/IIIB活性，为高效低毒抗病毒物质。实验结果表明SUMO融合表达适合表达全长序列的，无融合标签的重组CVN蛋白。该表达方法克服了其它表达方法产量低，易形成包涵体,纯化困难等缺点。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。序列表〈110>暨南大学〈120〉重组蓝藻抗病毒蛋白的制备方法及应用〈130>5〈160>21〈170>PatentInversion3.3〈210〉1〈211>1()5〈212>PRT〈213〉人工序列〈400〉1HisHisHisHisHisHisGlyMetSerAspSerGluValAsnGinGlu151015AlaLysProGluValLysProGluValLysProGluThrHislieAsn202530LeuLysValSerAspGlySerSerGluliePhePheLyslieLysLys354045ThrThrProLeuArgArgLeuMetGluAlaPheAlaLysArgGinGly505560LysGluMetAspSerLeuArgPheLeuTyrAspGlylieArglieGin65707580AlaAspGinThrProGluAspLeuAspMetGluAspAsnAsplielie859095GluAlaHisArgGluGinlieGlyGly100105〈210>2〈211>101〈212>:PRT〈213>Homosapiens〈400>2LeuGlyLysPheSerGinThrCysTyrAsnSerAlalieGinGlySer151015ValLeuThrSerThrCysGluArgThrAsnGlyGlyTyrAsnThrSer202530SerlieAspLeuAsnSerVallieGluAsnValAspGlySerLeuLys354045TrpGinProSerAsnPhelieGluThrCysArgAsnThrGinLeuAla505560GlySerSerGluLeuAlaAlaGluCysLysThrArgAlaGinGinPhe65707580ValSerThrLyslieAsnLeuAspAspHislieAlaAsnlieAspGly859095SThrLeuLysTyrGlu100〈210>3〈211)624〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈221>CDS〈222〉(1)(624)〈223〉根据大肠杆菌密码子偏好性，对CVN原始序列进行优化，通过多次PCR合成UMO-CVN的全序列〈400>3atgcatcatcatcatcatcacggcatgtcggac.teagaagtcaat.caaMetHisHisHisHisHisHisGlyMetSerAspSerGluValAsnGin15101548gaagetaagccagaggtcaagccagaagtcaagcctgagactcacateGluAlaLysProGluValLysProGluValLysProGluThrHislie20253096aatt.taaaggtgtecgatggatctteagagatettcttcasgateaaa144AsnL.euLysValSerAspGlySerSerGluliePhePheLyslieLys354045aagaccactcctttaagaaggctgatggaagcgttcgetaaaagacag192LysThrThrProLeuArgArgLeuMetGluAlaPheAlaLysArgGin505560ggtaaggaaatggactecttaagattcttgtacgacggtatt卿att240GlyLysGluMetAspSerLeuArgPheLeuTyrAspGlylieArglie65707580GingetAlagatcagAspGin3CCThr85CCtg33g3tProGluAspttgiLeugacAsp90EltgMetgagGluAspsacAsngatAsp95atelie288attgaggetcacagagaacagattggtggtcttggtaaatt.cteccag336lieGluAlaHisArgGluGinlieGlyGlyLeuGlyLysPheSerGin100105110acctgctacaactecgetatecagggttctgt:tctgacctctacc.tgc384ThrCysTyrAsnSerAlalieGinGlySerValLeuThrSerThrCys115120125gaacgtaccaacggtggttacaacacctectctategacctgaactec432GluArgThrAsnGlyGlyTyrAsnThrSerSerlieAspLeuAsnSer130135140gttategaaaacgttgacggttctctgaaatggcagccgtctaacttc480VallieGluAsnVaiAspGlySerLeuLysTrpGinProSerAsnPhe145150155160ategaaacctgccgtascacccagctggetgg.t.tectctgaactgget528lieG丄uThrCysArgAsnThrGinLeuAlaGlySerSerGluLeuAla165170175getgaatgcaaaacccgtgetcagcagttcgtttctaccaaaateaac576AlaGluCysLysThrArgAlaGinGinPheValSerThrLyslieAsn180185190ctggacgaccacategetaacategacggtaccctgaaatacgaatga624LeuAspAspHislieAlaAsnlieAspGlyThrL.euLysTyrGlu195200205〈210M〈211>207〈212>PRT〈213>人工序列〈400>4MetHisHisHisHisHisHisGlyMetSerAspSerGluValAsnGin151015GluAlaLysProGluValLysProGluValLysProGluThrHislie202530AsnLeuLysValSerAspGlySerSerGluliePhePheLyslieLys354045LysThrThrProLeuArgArgLeuMetGluA丄aPheAlaLysArgG丄n505560GlyLysGluMetAspSerLeuArgPheLeuTyrAspGlylieArglie65707580GinAlaAspGinThrProGluAspLeuAspMetGluAspAsnAsplie859095lieGluAlaHisArgGluGinlieGlyGlyLeuGlyLysPheSerGin100105110ThrCysTyrAsnSerAlalieGinGlySerValLeuThrSerThrCys115120125GluArgThrAsnGlyGlyTyrAsnThrSerSerlieAspLeuAsnSer130135140VallieGluAsnValAspGlySerLeuLysTrpGinProSerAsnPhe145150155160lieGluThrCysArgAsnThrGinLeuAlaGlySerSerGluLeuAla165170175AlaGluCysLysThrArgAlaGinGinPheValSerThrLyslieAsn180185190LeuAspAspHislieAlaAsnlieAspGlyThrLeuLysTyrGlu195200205〈210>5〈211>39〈212>丽〈213>人工序列〈220〉〈22〗)misc—feature〈222〉(1).(39)〈223〉多次PCR合成SUM0-CVN的全序列的....匕游引物之一F4-CVN〈400>5cagagaacagatt.ggtggtcttggtaaattctxccagac39〈210>6〈211)49〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈221>misc—feature〈222>(1)..(49)〈223>多次PCR合成SUMO-CVN的全序列的上游引物之一F3-CVN〈400>6ctgggtaaattctcccagacctgctacaactccgctatccagggttctg49〈210>7〈211)54〈212>丽〈213>人工序列〈220〉〈221〉misc_feature〈222〉(1).(54)〈223〉多次PCR合成SUM0-CVN的全序列的....匕游引物之一F2-CVN〈400>7ctccgctatccagggttctgttctgacctctacctgcgaacgtaccaacggtgg54〈210>8〈211>56〈212>DNA〈213>人工序列〈220〉〈22l>misc—feature〈222>(1)..(59)〈223〉多次PCR合成SUM0-CVN的全序列的上游引物之一Fi-CVN15〈400>8cgaacgtaccaacggtggttacaacacctcctctatcgacctgaactccgttatcg56〈210>9〈211>22〈212〉DNA〈213>人工序列〈220〉〈221>misc_feat.ure〈222〉(1)(22)〈223>多次PC:R合成SUM0-CVN的全序列的上游引物之一F-SUMO〈400>9cagcatatgcatcatcat.catc22〈210>10〈211>59〈212>I)NA〈213>人工序列〈220〉〈221>misc_feat.ure〈222〉(1)(59)〈223>多次PC:R合成SUMO-CVN的全序列的下游引物之一Rl-CVN〈400>10gaagttagacggctgccatttcagagaaccgtc朋cgtutcgataacggagUcaggt.59〈210>11〈211>57〈212〉DNA〈213>人工序列〈220〉〈221>misc_feat.ure〈222〉(1)(57)〈223>多次PC:R合成SUMO-CVN的全序列的下游引物之一R2-CVN〈400>11cag恥gaaccagccagctgggtgttacggcaggUtcg;U.gaagttagacggctgcc57〈210>12〈211>57〈212〉DNA16〈22l〉misc—feature〈222>(1)..(57)〈223〉多次PCR合成SUMO-CVN的全序列的下游引物之一R3-CVN〈400〉12cgaactgctgagcacgggttttgcattcagcagccagttcagaggaaccagccagct57〈210>13〈211>57〈212>I)NA〈213〉人工序列〈220〉〈221〉misc—feature〈222>(1)..(57)〈223〉多次PCR合成SUMO-CVN的全序列的下游引物之一R4-CVN〈400〉13gttagcgatgtggtcgtccaggt.tgaUUggtagaaacgaactgctgfigc;icgggt.57〈210>14〈211>57〈212>I)NA〈213>人工序列〈220〉〈22l〉misc—feature〈222>(1)..(57)〈223〉多次PCR合成SUMO-CVN的全序列的下游引物之一R5-CVN〈400〉14agaggatcctcatcattcgtatttcagggtaccgtcgatgttagcgatgtggtcgtc57〈210〉15〈211>37〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈221)misc—feature〈222>(1)..(37)〈223〉多次PCR合成SUMO-CVN的全序列的R游引物之一R-SUMO〈400〉15ctgggagaatttaccaagaccaccaat.ctgttctctg37〈210>16〈211〉21〈212>P:RT〈213>Homosapiens〈220〉〈221〉PEPTIDE〈222〉(1)(21)〈223〉肽指纹图谱T2肽段〈400〉16PheSerGinThrCysTyrAsnSerAlalieGinGlySerValLeuThr151015SerThrCysGluArg20〈210〉17〈211>24〈212>PRT〈213>Homosapiens〈220〉〈221):PEPT]:DE〈222>(1)..(24)〈223〉肽指纹图谱T3肽段〈400〉17ThrAsnGlyGlyTyrAsnThrSerSerlieAspLeuAsnSerVallie151015GluAsnValAspGlySerLeuLys20〈210〉18〈211>11〈212>PRT〈213>Homosapiens〈220〉〈221):PEPT]:DE〈222>(1)..(11)〈223〉肽指纹图谱T4肽段〈400〉18TrpGinProSerAsnPhelieGluThrCysArg1510〈210>19〈211>15〈212>PRT〈213>:Horaosapiens〈220〉〈221〉PEPTIDE〈222〉(1)..(15)〈223〉肽指纹图谱T5肽段〈400>19AsnThrGinLeuAlaGlySerSerGluLeuAlaAlaGluCysLys151015〈21()>2()〈211>8〈212>PRT〈213>Homosapiens〈220〉〈221〉PE:PTI:DE〈222〉(1)(8)〈223〉肽指纹图谱T7肽段〈400>20AlaGinGinPheValSerThrLys15〈210>21〈211〉15〈212>P:RT〈213>Homosapiens〈220〉〈221〉PEPTIDE〈222〉(1)(15)〈223〉肽指纹图谱T8肽段〈400>21lieAsnLeuAspAspHislieAlaAsnlieAspGlyThrLeuLys15101519权利要求1.一种表达载体，其特征在于所述表达载体包含编码蓝藻抗病毒蛋白N的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码的蛋白包含SEQIDNO:l和SEQIDNO:2的氨基酸序列。2.根据权利要求l所述的表达载体，其特征在于所述核苷酸序列为SEQIDNO:3。3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于所述表达载体为pET3cSUM0-CVN。4.一种包含权利要求1-3中任一项所述表达载体的寄主细胞。5.根据权利要求4所述的寄主细胞，其特征在于所述细胞为原核细胞。6.根据权利要求5所述的寄主细胞，其特征在于所述细胞为大肠杆菌。7.—种重组蓝藻抗病毒蛋白的制备方法，其特征在于培养权利要求4-6任一项所述寄主细胞，分离并纯化所需的重组蓝藻抗病毒蛋白。8.权利要求7所述方法制备得到的重组蓝藻抗病毒蛋白。9.权利要求1-3任一项所述表达载体和/或权利要求4-6任一项所述寄主细胞和/或权利要求8所述重组蓝藻抗病毒蛋白在制备抗病毒药物中的应用。全文摘要本发明提供了包含重组蓝藻抗病毒蛋白N核苷酸序列的表达载体和包含该表达载体的寄主细胞，并在此基础上提供了一种制备重组蓝藻抗病毒蛋白的方法，获得了重组蓝藻抗病毒蛋白，并进一步证明了所述表达载体和/或所述寄主细胞和/或所述重组蓝藻抗病毒蛋白能够应用于制备抗病毒药物。本发明的方法克服了现有技术产量低，易形成包涵体，纯化困难等缺点。利用本发明制备的重组CVN蛋白的肽质量指纹谱与理论肽质量指纹谱完全一致，并通过抗病毒实验证明了所得重组蛋白具有良好的抗病毒活性。文档编号A61K38/16GK101705241SQ20081019892公开日2010年5月12日申请日期2008年9月28日优先权日2008年9月28日发明者熊盛,王一飞,高相雷申请人:暨南大学