生物改性半夏蛋白的制备方法及其在制备抗肺癌药品中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种药物的制备方法及其新用途，具体涉及生物改性半夏蛋白的制备 方法及其在制备抗肺癌药品中的应用。
【背景技术】
[0002] 原发性支气管肺癌是最常见的肺部原发性恶性肿瘤，绝大多数起源于支气管黏膜 上皮，也有源于纤体或肺泡上皮者。
[0003] 肺癌的分子发病机制一班认为肺癌由遗传和环境及饮食等诸多因素相互作用所 致，其发病是一个多步骤的过程，涉及基因亚稳态集群运动的状态和表达调控。
[0004] 现在用于肺癌治疗的方法有手术治疗、放射治疗、化学治疗、生物治疗、中医治疗 和中西医结合治疗。
[0005] 201110053934. 8公开了一种蟾肽抗生素制成的用于治疗肺癌的药品，该发明采 用蟾蜍蛆虫为原料，用溶剂萃取、加温变性除蛋白、色谱柱分离、超声波液相制备色谱纯化 并用真空冷冻干燥制取的蟾肽抗生素为原料，再用适宜赋形剂相结合制备成各种剂型的药 品。
[0006] CN103310105A公开了筛选非小细胞肺癌治疗疗效生物标记物的方法，该发明采用 五个步骤对疗效生物标记物筛选，用于非小细胞肺癌治疗前的指导。
[0007] CN103720689A公开了一种TGF- M抑制剂在肺癌治疗中的用途，该发明利用 TGF-M抑制GF-M通道增加肺癌细胞的放射敏感性。
[0008] CN103536925A公开了强心苷化合物在非小细胞肺癌治疗中的应用，该发明涉及强 心苷化合物在制备用于治疗非小细胞肺癌的药物中的用途。
[0009] CN102575300A公开了肺癌治疗和诊断的靶基因CSTF2,该发明涉及CSTF2基因在 癌症发生中的作用，通过施用针对CSTF2基因的双链分子或含有此类双链分子的组合物、 载体或细胞来治疗或预防癌症。
[0010] CN103459422A公开了靶向HGF的多特异性抗原结合蛋白，该发明涉及HGF拮抗剂 和VEGF拮抗剂的组合，并且提供了结合HGF的抗原结合蛋白。
[0011] CN1846784公开了蛞蝓PEJI蛋白及其生产工艺，该发明涉及从蛞蝓体中提取蛞蝓 PEJg蛋白并制备成胶囊剂、颗粒剂、片剂、水针剂、冻干粉剂。
[0012] CN101878023A公开了靶向肺癌的肽及其应用，该发明提供了核酸、肽和抗体用于 诊断和治疗，并用肽与抗癌药物长春瑞滨或多柔比星的脂质体偶合，改进了这些药物的效 力。
[0013] 中药半夏为天南星科多年生草本植物，半夏的块根辛、温，有毒，入脾、胃经，具有 燥湿化痰、降逆止呕、消痞散结的功效。由于半夏的毒性限制了其用途，千百年来人们研宄 了各种炮制半夏的工艺。
[0014] 201210315547. 1公开了中药半夏蛋白生物改性工艺，该发明以中药半夏等多种原 料，采用特殊工艺过程生成昆虫体，将植物蛋白改性成动物重组基因蛋白，通过生物改性工 艺既降低了半夏蛋白的毒性，又赋予较好的生物活性功能。
【发明内容】
[0015] 本发明的目的是提供一种生物改性半夏蛋白的制备方法及其在制备抗肺癌药品 中的应用，本发明工艺过程中采用适宜的方法提取分离纯化生物改性半夏蛋白，并根据生 物改性半夏蛋白的理化特性、生物特性辅以相应的材料制备成不同剂型的药品。
[0016] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的： (1)将1000 g生物改性半夏虫体在常温膨化装置（200520108339. X)中常温条件下膨化 粉碎。
[0017] 本步骤中，所述膨化压力为0? l~5MPa，时间为10~60min。
[0018] (2)膨化粉碎后的物料加入到膨胀溶剂体系提取装置（201210179076. 6)中，加入 膨胀溶剂并加压至2~10MPa，形成膨胀溶剂体系，提取出生物改性半夏蛋白粗品。
[0019] 本步骤中，所述膨胀溶剂由l~10Kg液态二氧化碳、100~500mL甲醇及 100~300gNH 3 ? H2O组成或由l~10Kg液态二氧化碳、100~500mL乙醇及100~300g氯化铵组 成。
[0020] 本步骤中，所述提取温度为10~20°C，时间为10~30min。
[0021] (3)收集含有生物改性半夏蛋白粗品的溶液并且用微孔过滤器过滤去掉杂质。
[0022] 本步骤中，所述微孔过滤器的孔径为0. 5~50Mm。
[0023] (4)用超滤机超滤处理，收集含有相应分子量的生物改性半夏蛋白超滤溶液。
[0024] 本步骤中，所述超滤机的孔径为50~100nm。
[0025] (5)超滤液溶解在适宜的溶剂中用固相萃取柱分离，收集洗脱成分。
[0026] 本步骤中，所述溶剂为乙腈。
[0027] (6)将洗脱成分溶解在合适的溶剂体系中，用超声驻波液相制备色谱 (200920274485. 8)分离纯化。
[0028] 本步骤中，所述溶剂体系由正丁醇-乙酸乙酯-水(体积比1. 25:3. 75:5)组成或 4. 5%聚乙二醇-7%葡聚糖T500 (重量比）组成。
[0029] (7)纯化后的生物改性半夏蛋白用真空冷冻干燥机制备成冻干蛋白粉。
[0030] 本步骤中，所述真空冷冻干燥温度为_30~50°C、时间为18~26h。
[0031] (8)赋予不同的药用辅助材料，分别制备成注射剂、口服剂、栓剂，可用于制备抗肺 癌药品。
[0032] 本发明的优点和有益效果如下：通过本发明分离纯化的生物改性半夏蛋白 用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法及葡聚糖凝胶G-75凝胶过滤法测得相对分子量为 11. 2~12. 7KPa;用等电聚焦发测定其等电点为pH8. 6~9. 5;常规化学法分析结果表明其不 含糖类和磷酸基团；紫外分光光度法分析在260nm和280nm测定纯化的生物改性半夏蛋白 含量为98. 3%;分子结构属非典型、非单一的昆虫蛋白质，链内与链间不含二硫键，其三级 结构构象单元以无规卷曲为主，a螺旋与0折叠的含量比例基本相当。本发明制备的生 物改性半夏蛋白制剂质量稳定，结构清楚，药理明晰，疗效明显，含量可检可测，剂型多样， 成本较低，适合工业化生产。
【具体实施方式】
[0033] 下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限如此，凡是对 本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵 盖在本发明的保护范围中。
[0034] 实施例1: (1) 将1000 g生物改性半夏虫体干燥品装入常温膨化装置（200520108339. X)中，对 膨化装置内充入二氧化碳气体并加压至〇. l~5MPa，时间10~60min，然后迅速释放压力至常 压，生物改性半夏虫体被膨化成粉体； (2) 膨化粉碎后的生物改性半夏粉体加入到膨胀溶剂体系提取装置（201210179076. 6) 中，加入l~10Kg液态二氧化碳、100~500mL甲醇及100~300gNH3 *H20,加压至2~10MPa，形成 膨胀溶剂体系，保持温度l〇~20°C，时间10~30min，生物改性半夏粉体中的蛋白质溶解，然 后降压至常压，生成生物改性半夏蛋白粗品与甲醇-NH 3 ? H2O的混合液； (3) 收集含有生物改性半夏蛋白粗品的溶液，用孔径0. 5~50Mm的微孔过滤器过滤去处 固体杂质； (4) 溶液用孔径50~100nm的超滤机超滤处理，压力0. 3~0. 8MPa，温度为常温，收集含有 相应分子量的生物改性半夏蛋白超滤溶液； (5) 超滤溶液用20%乙腈溶解，C18固相萃取柱用50~100%乙腈活化预处理，加 0. 02~0. 1%三氟乙酸-水平衡，用10%乙腈溶液溶解的超滤溶液上柱，常温下用10~80%的 乙腈梯度脱洗，流速l~l〇mL/min，收集相关梯度的洗脱成分； (6) 将洗脱成分溶解在4. 5%聚乙二醇-7%葡聚糖T500 (重量比)溶剂体系中，用超声驻 波液相制备色谱（200920274485. 8)分离纯化，超声波功率0. 2~3. 0KW，频率500~1000KHz， 流速50~500mL/min，紫外检测器波长260~280nm ; (7) 纯化后的生物改性半夏蛋白用真空冷冻干燥机在温度-30~50°C、时间18~26h干燥 制备成冻干蛋白粉。
[0035] 实施例2: (1) 将1000 g生