一种大肠杆菌中融合荧光蛋白质的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术中荧光蛋白质和重组抗体领域，具体的说是涉及一种大肠杆 菌中融合荧光蛋白质的制备方法。
【背景技术】
[0002] 藻胆蛋白是藻类重要的色素蛋白，具有光能捕获和传递的作用。每分子的藻胆蛋 白含有两条结构相似的多肽链α和β，α亚基和β亚基分别含有约160~180个氨基酸 残基，二者的比例通常为1:1。亚基中的半胱氨酸残基通过硫醚键与藻胆色素共价结合，藻 胆色素的种类及其与脱辅基蛋白的相互作用决定了藻胆蛋白的光谱学性质。根据吸收光谱 的不同，可将藻胆蛋白分为4大类：即藻红蛋白PE, λ_= 540nm~570nm，藻红蓝蛋白PEC， Xmax= 567nm，藻蓝蛋白 PC，λ max= 615nm ~640nm 和别藻蓝蛋白 APC，λ max= 650nm ~ 655nm〇
[0003] 藻胆蛋白能发出强烈的荧光，其荧光特性最重要的用途是在免疫诊断用荧光标 记、生物医学研究等方面，可将其与生物素、亲和素或各种抗体结合制成荧光探针，用于免 疫荧光分析和检测等工作中。
[0004] 在免疫荧光分析中，藻胆蛋白作为荧光标记物需要与抗体结合，即通过双功能试 剂将藻胆蛋白分子与抗体分子共价交联，或通过生物素?亲和素系统（BAS)将藻胆蛋白分 子间接耦联到抗体分子上。无论通过何种方式标记，都需要分别制备藻胆蛋白和抗体。藻 胆蛋白与抗体通过化学交联剂直接交联，可能会降低抗体活性和藻胆蛋白的荧光强度。而 通过生物素?亲和素系统，则需要将藻胆蛋白和链霉亲和素通过化学交联的方式偶联起来， 抗体则需要经过生物素化处理。因此，藻胆蛋白和抗体无论是通过直接交联还是通过BAS 系统间接偶联，过程均较复杂，制备的成本很高。简化制备步骤，降低生产成本，将有助于拓 展藻胆蛋白荧光探针的应用。
[0005] 单链抗体是一种小分子抗体，它由一段弹性连接链把抗体重链可变区与轻链可变 区相连而成，是具有亲代抗体全部抗原结合特异性的最小功能结构单位。它具有分子量小， 只有完整抗体分子的1/6,能以单价的形式结合特异性抗原，免疫原性低，组织穿透力强，可 以利用基因工程方法进行异源表达，从而降低生产成本。
【发明内容】
[0006] 本发明目的在于提供一种大肠杆菌中融合荧光蛋白质的制备方法。
[0007] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
[0008] -种大肠杆菌中融合荧光蛋白质的制备方法：将AFP单链抗体基因和别藻蓝蛋白 α亚基基因通过linker序列拼接成嵌合基因，并将该嵌合基因、藻胆蛋白裂合酶基因和藻 胆色素生物合成酶基因在大肠杆菌中共表达，获得共价结合藻红胆素的融合荧光蛋白质或 共价结合藻蓝胆素的融合荧光蛋白；
[0009] 所述藻胆色素为藻红胆素或藻蓝胆素。
[0010] 具体是：
[0011] 1)利用融合PCR，将AFP单链抗体基因，linker序列和别藻蓝蛋白亚基基因连接 形成嵌合基因，将该嵌合基因插入到大肠杆菌表达载体PCDFDuet-I的一个表达框中；将裂 合酶基因 cpcS插入到该表达载体的另一个表达框中；
[0012] 2)将藻红胆素生物合成酶基因 Hol和pebS，分别插入到另一个表达载体 pRSFDuet-1的两个表达框中；
[0013] 3)将两个构建好的表达载体同时转化大肠杆菌，得到重组大肠杆菌；
[0014] 4)将重组大肠杆菌进行发酵培养，IPTG诱导融合蛋白表达，通过复性和金属螯合 亲和层析纯化，得到共价结合藻红胆素的融合荧光蛋白质。
[0015] 所述别藻蓝蛋白α亚基基因是别藻蓝蛋白Synechococcus CC9311 α亚基或其 同源基因，藻红胆素生物合成酶基因 Hol是Synechocystis sp.PCC6803 Hol基因，pebS是 指 Prochlorococcus phage P-SSM2 的 pebS 基因 ，cpcS 是指 Synechoccus elongatus BP-1 cpcS 基因（T11 1699) ,linker 序列是：
[0016] GGATCCGCCGAAGCGGCCGCAAAAGAAGCTGCGGCCAAGGAAGCAGCTGCGAAAGAAGCCGCAGCTAAG GCGGAATTCo
[0017] 具体是：
[0018] 1)利用融合PCR，将AFP单链抗体基因，linker序列和别藻蓝蛋白α亚基基因连 接形成嵌合基因，将该嵌合基因插入到大肠杆菌表达载体pCDFDuet-Ι的一个表达框中；将 裂合酶基因 cpcS插入到该表达载体的另一个表达框中；
[0019] 2)将藻蓝胆素生物合成酶基因 Hol和PcyA分别插入到另一个表达载体 pRSFDuet-1的两个表达框中；
[0020] 3)将两个构建好的表达载体同时转化大肠杆菌，筛选出同时表达上述多个基因的 菌株并能够生产融合荧光蛋白质的菌株，即得表达菌株；
[0021] 4)将表达菌株进行发酵培养，IPTG诱导融合蛋白表达，利用金属螯合亲和层析纯 化，从而得到共价结合藻蓝胆素的融合荧光蛋白质。
[0022] 所述别藻蓝蛋白α亚基基因是别藻蓝蛋白Synechococcus CC9311 α亚基或其同 源基因，藻蓝胆素生物合成酶基因 Hol是Synechocystis sp. PCC6803 Hol基因，pcyA是指 Synechocystis sp. PCC 6803 的 pcyA 基因，裂合酶基因 cpcS 是指 Synechoccus elongatus BP-1 cpcS 基因（T11 1699) ,linker 序列是：
[0023] GGATCCGCCGAAGCGGCCGCAAAAGAAGCTGCGGCCAAGGAAGCAGCTGCGAAAGAAGCCGCAGCTAAG GCGGAATTCo
[0024] 与现有技术相比，本发明具有以下优点：
[0025] 1.本发明中融合荧光蛋白质是通过基因工程方式获得，不需要单独制备抗体和藻 胆蛋白，降低了制备成本；
[0026] 2.本发明中抗体和藻胆蛋白通过融合表达，两者之间直接结合，不需要通过化学 交联剂处理，简化制备流程；
[0027] 3.本发明利用大肠杆菌发酵生产AFP单链抗体和别藻蓝蛋白α亚基融合蛋白 (scFv-apcA)，大肠杆菌易于培养、生长快，缩短生产周期；
[0028] 4.大肠杆菌易于破碎，由于重组蛋白携带HIS标签，利用亲和层析可获得高纯度 的重组蛋白，简化纯化过程；
[0029] 5.融合荧光蛋白质共价结合藻红胆素或藻蓝胆素，为免疫荧光检测提供更多选 择。
【附图说明】
[0030] 图1是本发明实施例的经过纯化后的融合荧光蛋白质scFv-apcA-PEB的吸收光 谱。
[0031] 图2是本发明实施例的经过纯化后融合荧光蛋白质scFv-apcA-PEB的荧光发射光 谱。
[0032] 图3是本发明实施例的融合荧光蛋白质scFv-apcA-PEB蛋白竞争性抑制试验图。
【具体实施方式】。
[0033] 图4是本发明实施例的经过纯化后的融合荧光蛋白质scFv-apcA-PCB的吸收光 谱。
[0034] 图5是本发明实施例的经过纯化后融合荧光蛋白质scFv-apcA-PCB的荧光发射光 谱。
[0035] 图6是本发明实施例的融合荧光蛋白质scFv-apcA-PCB蛋白竞争性抑制试验图。
【具体实施方式】
[0036]
[0037] 下面通过实施例对本发明的【具体实施方式】进行阐述，所述的实施方式仅仅用来解 释和说明本发明，其并不限制本发明的保护范围。任何本领域技术人员根据公知的知识和 现有技术的教导能够想到的等价的变体都包含在本发明的保护范围中。
[0038] 实施例1
[0039] L基因的克隆
[0040] 从美国国立生物信息中心（National Centre for Biotechnology Information, NCBI)数据库获取 Synechococcus CC9311 apcA，Synechocytissp. PCC 6803 Hoi, Prochlorococcus phage P-SSM2 pebS, Synechococcus elongatus BP-I cpcS 和 AFP单链抗体scFv基因序列（Accession No.AGQ46838)。由此分别设计扩增apcA，Hol， cpcS和scFv基因的特异引物（表1)。apcA基因以CC9311基因组DNA为模板，Hol以 Synechocytissp. PCC 6803 基因组 DNA 为模板，cpcS 以 Synechococcus elongatus BP-1 基 因组DNA为模板，按常规PCR条件扩增获得。pebS、scFv基因和linker序列由南京金斯瑞 生物科技有限公司人工合成。为了便于融合PCR反应，linker序列人工合成过程中，在其 5'端和3'端分别加上scFv基因和apcA基因的部分序列。
[0041] 2.重组质粒的构建
[0042] 以scFv、linker和apcA为模板，用引物scFvF和引物9311apcAR，通过融合PCR 扩增，获得嵌合基因 scFv-apcA。scFv-apcA片段回收后，利用BamHI和SacI双酶切，同时 把载体pCDFDuet-Ι也利用相同的酶进行双酶切。分别回收嵌合基因片段和载体，然后以 5:1的摩尔比进行连接。16°C条件下连接过夜后，将连接产物转化大肠杆菌ToplO。从转 化平板上挑取克隆做菌液PCR，阳性克隆送样测序。验证无误后保种，构建成功的重组质粒 pCDF-scFv-apcA用于下一步实验。
[0043] 将扩增得到的cpcS基因回收后用BglII和Sail双酶切，pCDF-scFv-apcA利用 BglII和XhoI双酶切，分别cpcS片段和载体片段回收后，以5:1摩尔比连接。16°C条件下 连接过夜后，将连接产物转化大肠杆菌ToplO。从转化平板上挑取克隆做菌液PCR，阳性克 隆送样测序。验证无误后保种，构建成功的质粒P⑶F-scFv-apcA-cpcS用于后续实验。
[0044] 将扩增得到Hol基因回收后用BglII和Sail双酶切，pRSFDuet-Ι载体用BglII和 XhoI双酶切。分别回收基因片段和载体片段，以5:1摩尔比进行连接。16°C条件下连接过 夜后，将连接产物转化大肠杆菌ToplO。从转化平板上挑取克隆做菌液PCR，阳性克隆送样 测序。测序验证无误的克隆用于保种，构建成功的质粒PRSF-Hol用于后续实验。
[0045] 人工合成的基因 pebS和质粒pRSF-Hol均用NcoI和Sail酶切，分别回收pebS基 因片段和载体片段，以5:1摩尔比进行连接，16°C条件下连接过夜后，将连接产物转化大肠 杆菌ToplO。从转化平板上挑取克隆做菌