液PCR，阳性克隆送样测序。测序验证无误的克隆 用于保种，构建成功的质粒pRSF-Hol-pebS用于后续实验。
[0046] 3.重组菌株的构建与筛选
[0047] 将上述构建好的质粒通过共转化导入大肠杆菌BL21 (DE3)，转化后的大肠杆菌涂 布在含有卡那霉素和壮观霉素的LB平板上，37°C过夜培养后。挑取20个克隆，分别接种 于3mL LB培养基（培养基中含有抗生素卡那霉素和壮观霉素）中，37°C培养过夜。从中吸 取150 μ L的培养物，转接到含有相应抗生素的5mL LB培养基中，37°C，200RPM条件下培养 4小时，加入终浓度为ImM IPTG诱导，培养物置于18°C，150RPM继续培养16-20小时。离 心收集菌体，菌体的颜色变为红色。利用超声波细胞粉碎机破碎细胞，利用收集上清，加入 Loading Buffer后煮沸处理10分钟，取样进行SDS-PAGE电泳。选择重组蛋白表达量高的 菌株，保甘油种用于后续发酵与重组蛋白的分离纯化。
[0048] 4.重组蛋白（scFv-apcA-PEB)的发酵与分离纯化
[0049] 吸取甘油种200 μ L，接种于含有卡那霉素和壮观霉素的LB培养基中，37°C过夜培 养后。吸取6mL过夜培养物，接种于含有卡那霉素和壮观霉素的300mL LB培养基中。37°C， 200RPM条件下培养4小时，加入终浓度为ImM IPTG，18°C条件下诱导16小时。
[0050] 离心收集菌体，将菌体悬浮于PBS溶液中，冰浴中超声破碎，破碎液于4°C， 8000rpm条件下离心20min，弃上清，收集包涵体。向包涵体中加入一定体积的变性液 (20mmol/L Tris-HCl，口!18.0，10_31/1^-疏基乙醇，8111〇1凡尿素），用磁力搅拌器4<€下 缓慢搅拌12h使沉淀缓慢溶解，4°C，6000rpm离心10min，收集复性液。将复性液倒入处理 过的透析袋中，将透析袋置于含4mol/L尿素的透析缓冲液，用磁力搅拌器4°C下缓慢搅拌 透析，每透析12h倒去1/2体积的透析液，加入1/2体积新鲜的无尿素的透析缓冲液继续透 析，48h后换PBS缓冲液平衡24h。复性完成后将透析液小心倒入离心管中，4°C，1000 Orpm 离心10min，收集上清液。上清样品过结合缓冲液（500mmol/L NaCl，15. 5mmol/L Na2HPO4, 4. 5mmol/L NaH2P04,20mmol/L咪唑，pH 7. 4)平衡好的镍柱，再用洗涤液洗涤（500mmol/L 似(：1，15.5臟〇1/1似2册04,4.5臟〇1/1似氏?04,50臟〇1/1咪唑，口!17.4)镍柱，待检测不到蛋 白信号时，用洗脱液（500mmol/L NaCl，15. 5mmol/L Na2HPO4,4. 5mmol/L NaH2PO4, 500mmol/L 咪唑，pH 7.4)进行洗脱，收集流出液，再过G25脱盐柱，除去蛋白样品中的咪唑，得到重组 蛋白溶液。
[0051] 5.重组蛋白（scFv-apcA-PEB)的光谱学性质和免疫活性
[0052] 分别测定重组蛋白的吸收光谱和荧光发射光谱。吸收光谱采用UV1801分光光度 计室温条件下测定，测量结果见图1，重组蛋白的最大吸收峰为549. 5nm。荧光发射光谱采 用F-4500荧光分光光度计，荧光激发波长为500nm，扫描波长为500-600nm，荧光发射光谱 见图2,最大荧光发射波长为560nm。本实验结果说明，重组蛋白具有与藻胆蛋白类似的光 谱学性质。
[0053] 采用竞争抑制性ELISA测定目的蛋白活性，将AFP亲本单抗和不同比例的 scFv-apcA，加入包被AFP抗原的96孔酶标板，37°C孵育2h，PBST洗涤3次后加入HRP标记 的抗小鼠 IgG抗体50 μ L，37°C孵育2h，加底物显色15分钟后终止反应。测定A450值，设立 加 PBS的AFP亲本单抗作为阳性对照，每个浓度设3个复孔，方法同上。竞争抑制率（％ ) =(A450亲本单抗-A450scFv-apcAV(A450亲本单抗-A450空白）。竞争性抑制试验结果 见图3,结果显示融合蛋白具有免疫学活性。
[0054] 表1 PCR扩增中使用的特异引物
[0057] 实施例2
[0058] 1.基因的克隆
[0059] 从美国国立生物信息中心（National Centre for Biotechnology Information, NCBI)数据库获取 Synechocytissp. PCC 6803 apcA，Synechocytissp. PCC 6803 Hol，Prochlorococcus phage P-SSM2 pebS，Synechococcus elongatus BP-1 cpcS和 AFP单链抗体scFv基因序列（Accession No. AGQ46838)。由此分别设计扩增apcA，Hol，cpcS 和scFv基因的特异引物（表1)。apcA基因以Synechocytissp. PCC 6803基因组DNA为模 板，Hol 以 Synechocytissp. PCC 6803 基因组DNA为模板，cpcS 以 Synechococcus elongatus BP-I基因组DNA为模板，按常规PCR条件扩增获得。pebS、scFv基因和linker序列由南京 金斯瑞生物科技有限公司人工合成。为了便于融合PCR反应，linker序列人工合成过程中， 在其5'端和3'端分别加上scFv基因和apcA基因的部分序列。
[0060] 2.重组质粒的构建
[0061] 以scFv、linker和apcA为模板，用引物scFvF和6803apcAR，通过融合PCR扩 增，获得嵌合基因 scFv-apcA。scFv-apcA片段回收后，利用BamHI和SacI双酶切，同时 把载体pCDFDuet-Ι也利用相同的酶进行双酶切。分别回收嵌合基因片段和载体，然后以 5:1的摩尔比进行连接。16°C条件下连接过夜后，将连接产物转化大肠杆菌ToplO。从转 化平板上挑取克隆做菌液PCR，阳性克隆送样测序。验证无误后保种，构建成功的重组质粒 pCDF-scFv-apcA用于下一步实验。
[0062] 将扩增得到的cpcS基因回收后用BglII和Sail双酶切，pCDF-scFv-apcA利用 BglII和XhoI双酶切，分别cpcS片段和载体片段回收后，以5:1摩尔比连接。16°C条件下 连接过夜后，将连接产物转化大肠杆菌ToplO。从转化平板上挑取克隆做菌液PCR，阳性克 隆送样测序。验证无误后保种，构建成功的质粒P⑶F-scFv-apcA-cpcS用于后续实验。
[0063] 将扩增得到Hol基因回收后用BglII和Sail双酶切，pRSFDuet-Ι载体用BglII和 XhoI双酶切。分别回收基因片段和载体片段，以5:1摩尔比进行连接。16°C条件下连接过 夜后，将连接产物转化大肠杆菌ToplO。从转化平板上挑取克隆做菌液PCR，阳性克隆送样 测序。测序验证无误的克隆用于保种，构建成功的质粒PRSF-Hol用于后续实验。
[0064] 人工合成的基因 pebS和质粒pRSF-Hol均用NcoI和Sail酶切，分别回收pebS基 因片段和载体片段，以5:1摩尔比进行连接，16°C条件下连接过夜后，将连接产物转化大肠 杆菌ToplO。从转化平板上挑取克隆做菌液PCR，阳性克隆送样测序。测序验证无误的克隆 用于保种，构建成功的质粒pRSF-Hol-pebS用于后续实验。
[0065] 3.重组菌株的构建与筛选
[0066] 将上述构建好的质粒通过共转化导入大肠杆菌BL21 (DE3)，转化后的大肠杆菌涂 布在含有卡那霉素和壮观霉素的LB平板上，37°C过夜培养后。挑取20个克隆，分别接种 于3mL LB培养基（培养基中含有抗生素卡那霉素和壮观霉素）中，37°C培养过夜。从中吸 取150 μ L的培养物，转接到含有相应抗生素的5mL LB培养基中，37°C，200RPM条件下培养 4小时，加入终浓度为ImM IPTG诱导，培养物置于18°C，150RPM继续培养16-20小时。离 心收集菌体，菌体的颜色变为红色。利用超声波细胞粉碎机破碎细胞，利用收集上清，加入 Loading Buffer后煮沸处理10分钟，取样进行SDS-PAGE电泳。选择重组蛋白表达量高的 菌株，保甘油种用于后续发酵与重组蛋白的分离纯化。
[0067] 4.重组蛋白（scFv-apcA-PEB)的发酵与分离纯化
[0068] 吸取甘油种200 μ L，接种于含有卡那霉素和壮观霉素的LB培养基中，37°C过夜培 养后。吸取6mL过夜培养物，接种于含有卡那霉素和壮观霉素的300mL LB培养基中。37°C， 200RPM条件下培养4小时，加入终浓度为ImM IPTG，18°C条件下诱导16小时。
[0069] 离心收集菌体，将菌体悬浮于PBS溶液中，冰浴中超声破碎，破碎液于4°C， 8000rpm条件下离心20min，弃上清，收集包涵体。向包涵体中加入一定体积的变性液 (20mmol/L Tris-HCl，口!18.0，10_31/1^-疏基乙醇，8111〇1凡尿素），用磁力搅拌器4<€下 缓慢搅拌12h使沉淀缓慢溶解，4°C，6000rpm离心10min，收集复性液。将复性液倒入处理 过的透析袋中，将透析袋置于含4mol/L尿素的透析缓冲液，用磁力搅拌器4°C下缓慢搅拌 透析，每透析12h倒去1/2体积的透析液，加入1/2体积新鲜的无尿素的透析缓冲液继续透 析，48h后换PBS缓冲液平衡24h。复性完成后将透析液小心倒入离心管中，4°C，1000 Orpm 离心10min，收集上清液。上清样品过结合缓冲液（500mmol/L NaCl，15. 5mmol/L Na2HPO4, 4. 5mmol/L NaH2P04,20mmol/L咪唑，pH 7. 4)平衡好的镍柱，再用洗涤液洗涤（500mmol/L NaCl，15.5mmol/L Na2HP04,4.5mmol/L NaH2PO4, 50mmol/L咪唑，pH 7.4)镍柱，待检测不到蛋 白信号时，用洗脱液（500mmol/L NaCl，15. 5mmol/L Na2HPO4,4. 5mmol/L NaH2PO4, 500mmol/L 咪唑，pH 7.4)进行洗脱，收集流出液，再过G25脱盐柱，除去蛋白样品中的咪唑，得到重组 蛋白溶液。
[0070] 5.重组蛋白（scFv-apcA-PEB)的光谱学性质和免疫活性
[0071] 分别测定重组蛋白的吸收光谱和荧光发射光谱。吸收光谱采用UV1801分光光度 计室温条件下测定，测量结果见图1，重组蛋白的最大吸收峰为549. 5nm。荧光发射光谱采 用F-4500荧光分光光度计，荧光激发波长为500nm，扫描波长为500-600nm，荧光发射光谱 见图2,最大荧光发射波长为560nm。本实验结果说明，重组蛋白具有与藻胆蛋白类似的光 谱学性质。
[0072] 采用竞争抑制性ELISA测定目的蛋白活性