一种生物活性透明质酸片段、其生产方法、应用、制剂及含有该制剂的物品的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及化妆品、护肤品、卫生用品、生物医药领域，具体地，涉及一种生物活性 透明质酸片段、其生产方法、应用、制剂及含有该制剂的物品。
【背景技术】
[0002] 透明质酸，又称玻璃酸、糖酸酸、玻尿酸，英文名hyaluronic acid(简称HA),是 由D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺组成的高级多糖，双糖单位可达25000道尔。人体皮下 组织、表皮、角质层、皮脂腺、毛囊和粘膜含有大量的透明质酸，皮肤成熟和老化过程也随 着透明质酸的含量和新陈代谢而变化，随着年龄的增长及机体的老化，18岁时透明质酸就 开始流失，25岁以后开始加速流失，30岁的肌肤，透明质酸的含量只有婴儿时期的65%， 到了 60岁只有25%。透明质酸是自然界中发现的保湿性能最好的物质，皮肤中的水分也会 跟着透明质酸的流逝而散失，人体皮肤表层（角质层）水分含量约占20-35%，颗粒层含水 量50-60%，低于或高于此值均不适，具有燥感或腻感，长期如此，会使皮肤干裂或水肿， 从而使皮肤失去弹性，粗糙老化。目前，透明质酸的生产厂家很多，主要使用微生物发酵 方法，多选用链球菌或乳酸球菌做菌种，以葡萄糖作为碳源发酵液，发酵结束后，过滤除 去菌丝体和杂质，然后乙醇沉淀得到高纯度的透明质酸产物。
[0003] 大分子透明质酸在皮肤粘膜表面形成一个透气的膜，主要是保护和湿化皮肤，基 本没有其他生物活性，如何利用大分子透明质酸，开发其多种用途，实属当前重要研发课题 之一。
【发明内容】
[0004] 我们最近的研究表明，人体主要细胞外基质大分子透明质酸参与人体非特异性免 疫功能的调节是通过炎症区产生的有透明质酸酶活性的物质切割大分子透明质酸后产生 的低分子透明质酸来实现，即有生物活性的透明质酸是被能识别透明质酸正常结构的透明 质酸酶切割的末端和适当分子量的低分子量的透明质酸，这种生物活性透明质酸和受体结 合能力增加，从而促进皮肤粘膜组织分泌杀菌抗病毒的防卫素2和抑制炎症。
[0005] 本发明的目的在于提供一种透明质酸片段的生产方法，可使不具有生物活性的大 分子透明质酸变为安全的且具有较高生物活性的透明质酸片段。
[0006] 本发明的第二个目的在于提供一种安全的具有生物活性的透明质酸片段。
[0007] 本发明的第三个目的在于提供一种具有生物活性的透明质酸片段的应用。
[0008] 本发明的第四个目的在于提供一种安全的、具有生物活性的透明质酸类制剂。
[0009] 本发明的第五个目的在于提供一种含有生物活性透明质酸类制剂的物品。
[0010] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0011] -种生物活性透明质酸片段的生产方法，以大分子透明质酸为原料，使用CHO细 胞生产的有糖化的重组人透明质酸酶PH20进行切割，制成分子量为10KD-60KD透明质酸 片段，所述片段至少有一端是使用能识别透明质酸正常结构的重组人透明质酸酶切割的末 端。
[0012] 进一步地，在进行重组人透明质酸酶酶切割前，先对原料进行烘烤和/或溶解臭 氧处理来降低分子量。
[0013] 进一步地，所述大分子透明质酸是纯度为90. 0%-99. 9%的分子量为1000-1800KD 的透明质酸原料，当进行烘烤和溶解臭氧处理时，两者的顺序是先110-120度烘烤后溶解 臭氧处理。
[0014] 进一步地，所述大分子透明质酸是纯度为90. 0%-99. 9%的分子量为200-600KD的 透明质酸原料。
[0015] 进一步地，所述重组人透明质酸酶切割条件为：在pH5. 0-5. 5、37度和存在NaCl、 Mg离子和Ca离子的条件下切割。
[0016] 进一步地，所述CHO细胞生产的有糖化的重组人透明质酸酶PH20是使用富含GC 动物细胞表达载体pMH3、4或5在CHO-S细胞系稳定表达和生产的，所述重组人透明质酸酶 PH20的基因序列如SEQ ID No. 1所示。
[0017] -种生物活性透明质酸片段，采用上述的生产方法生产得到。
[0018] 上述生物活性透明质酸片段的应用，所述片段具有促进组织、细胞、皮肤、粘膜分 泌防卫素2和抑制皮肤粘膜组织炎症的生物活性，并具有抑制皮肤过多油脂分泌的生物活 性，用于制备杀灭微生物、抑制皮肤粘膜组织炎症疾病和/或抑制皮肤过多油脂分泌的制 剂，或用于制备含有杀灭微生物、抑制皮肤粘膜组织炎症疾病和/或抑制皮肤过多油脂分 泌的制剂的物品。
[0019] -种生物活性透明质酸类制剂，含有上述分子量为10KD-60KD的透明质酸片段。
[0020] 进一步地，所述制剂包含1-4%质量百分浓度的分子量为10KD-60KD透明质酸片 段。
[0021] 进一步地，所述制剂还包含5-10mg/L金环蛇抗菌肽BF或者15-30mg/L人抗菌肽 LL-37。
[0022] 进一步地，还包括5000-10000单位/ml的干扰素。
[0023] 进一步地，所述制剂为滴眼液或眼部护理液或漱口口服液或注射点滴液。
[0024] 进一步地，还包括1-3%质量百分浓度的甘油。
[0025] 进一步地，所述制剂为皮肤喷剂、尿布性皮炎喷剂、液体创口贴或口腔牙龈鼻咽喷 剂。
[0026] 进一步地，还包括0. 15-0. 3%质量百分浓度的分子量为200KD-400KD透明质酸、 0. 05-1. 5%质量百分浓度的分子量为1800KD或以上的透明质酸。
[0027] 进一步地，所述制剂为面膜、尿布性皮炎膜、头皮护理液或阴道护理液。
[0028] 进一步地，还包括1-3%质量百分浓度的甘油、0. 15-0. 3%质量百分浓度的分子量 为200KD-400KD透明质酸、0. 05-1. 5%质量百分浓度的分子量为1800KD或以上的透明质酸。
[0029] 进一步地，所述制剂为避孕套润滑液，所述避孕套润滑液用于保护子宫颈、阴道和 外阴皮肤炎症性疾病或用于综合精液中的透明质酸酶防止精子通过子宫颈粘液栓进入卵 子。
[0030] 进一步地，所述制剂为饮品添加剂，所述饮品添加剂含有1-2%质量百分浓度的分 子量为10KD-60KD透明质酸片段液体或喷干粉。
[0031] 进一步地，所述制剂为肺吸入剂，所述10KD-60KD透明质酸片段为干粉。
[0032] 进一步地，还包含金环蛇抗菌肽BF或者人抗菌肽LL-37 ;所述10KD-60KD透明质 酸片段干粉与金环蛇抗菌肽BF的重量比为0. 1-1. 0 :0. 01-0. 02 ;所述10KD-60KD透明质酸 片段干粉与人抗菌肽LL-37的重量比为0. 1-1. 0 :0. 03-0. 06。
[0033] 进一步地，每0· 1-1. Omg的10KD-60KD透明质酸片段干粉，还配合有5000-10000 单位的干扰素。
[0034] 进一步地，所述制剂为干粉口服剂，所述10KD-60KD透明质酸片段为干粉。
[0035] 进一步地，还包含氨基葡萄糖，所述10KD-60KD透明质酸片段干粉与氨基葡萄糖 的重量比为50-200 :50-1000。
[0036] -种含有生物活性透明质酸类制剂的物品，所述物品为纸尿裤，所述纸尿裤的内 表面包覆层内含有上述的生物活性透明质酸类制剂。
[0037] 由于采用上述技术方案，本发明至少具有以下优点：
[0038] 1、使用CHO细胞生产的有糖化的重组人透明质酸酶，没有免疫原性，不引起过敏 反应，少量残留在最终产品中没有安全性问题。
[0039] 2、经实验验证了有生物活性的透明质酸是具有透明质酸酶切割的末端和适当分 子量的低分子量的透明质酸，具有能识别透明质酸正常结构的透明质酸酶切割的末端低分 子量透明质酸（10KD-60KD)可以和受体结合，促进皮肤粘膜组织分泌杀菌抗病毒的防卫素 2,有杀灭微生物和抗炎的生物活性，还具有抑制皮肤过多油脂分泌的生物活性。
[0040] 3、生产方法中采用的烘烤，其使用物理方法可减少大分子透明质酸原料溶解后的 分子量和粘度，并进一步去除大分子透明质酸原料中的残留有机物和酸性物质；溶解臭氧 处理，其使用化学方法可进一步减少大分子透明质酸原料溶解后的分子量、粘度，并除色除 味。
[0041] 4、联合上述生物活性透明质酸片段、金环蛇抗菌肽或者人抗菌肽
[0042] LL-37、甘油等制成复方制剂（喷剂、滴剂、护理剂、洗剂、贴剂、漱口 口服剂、饮品添 加剂、肺吸入剂、干粉口服剂、静脉注射点滴液等)，可广泛用于预防和治疗皮肤粘膜组织炎 症性疾病。
【具体实施方式】
[0043] 以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用 于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
[0044] 实施例1
[0045] 目的：重组人透明质酸酶PH20的基因构建、表达、免疫学检测、活性检测和反应器 生产。
[0046] 方法：申请人利用有自主知识产权的非基因拷贝扩增技术，即富含GC动物细胞 表达技术（W0/2008/091276)和动物细胞反应器（W02006/138143和W02007/142664)技术， 使用新型CHO细胞（CHO-S)生产出高质量可商业化的重组人透明质酸酶PH20。具体为：通 过PCR的方法将表达PH20氨基酸顺序的结构基因 （SEQ ID No. 1)合成，并构建到富含GC 的动物细胞表达载体pMH3、4或5中，已在W0/2008/091276中公开。小量制备这几种表达 质粒后，稳定转染到无血清悬浮培养的新型CHO细胞（CHO-S)中。通过G418筛选，用枪头 手动挑取稳定克隆到96孔板中。当细胞汇合度大于50%时，更换无血清新鲜培养基；3-6 小时后，收集培养基样品，通过检测透明质酸酶生物活性，选出表达量最高的克隆多个。在 40ml摇瓶悬浮流加培养13天，活性单位呈增长趋势，最高收液培养液中活性单位为2000U/ ml。继续在尖底小摇瓶内进行无血清培养和做传代稳定性研究；选出传代稳定的克隆在5L 激流式反应器内进行扩增。PH20在AP20SC (5L)反应器上的大规模培养工艺开发：接种密 度：2X 106 个 cells/ml ;参数工艺：T :生长期 37°C，表达期 34°C ;D0 :5-10% ;PH :6· 8-7. 2 ; 生长期培养基：B001，流加培养基：FOOl+糖；培养进入表达期后，每天调一次PH至6. 8,然 后关闭加碱泵；培养周期16天，最高活性为3522U/ml。
[0047] 结果：（1)重组人透明质酸酶PH20在新型CHO细胞（CHO-S)中成功表达，western blot结果表明筛选到重组人透明质酸酶PH20稳定高表达克隆所产生的条带分子量大小正 确；（2)高表达克隆在尖底小摇瓶内进行无血清培养和做传代稳定；（3)稳定的高表达克隆 在5L激流式反应器内进行流加培养扩增，各批次丰收液中透明质酸酶活性达到1800-3500 活性单位/毫升，达到了工业化生产水平。
[0048] 结论：使用富含GC的动物细胞表达载体pMH3、4或5,重组人透明质酸酶PH20在 新型CHO细胞（CHO-S)中成功表达，各批次丰收液中透明质酸酶活性达到1800-3500活性 单位/毫升，即每毫升培养液可以生产150单位的注射用重组人透明质酸酶5-10支，满足 工业化生产要求。
[0049] 实施例2
[0050] 目的：重组人透明质酸酶PH20的分离纯化。
[0051] 方法：发酵液前处理：将所得5L激流式反应器所得发酵液使用固液分离装置(离 心机、膜包、中空纤维柱、套筒等)获得上清，在IOmM Tris pH7. 5中切向流透析，然后通过Q 琼脂糖离子交换层析、苯基琼脂糖疏水相互作用层析、羟基磷灰石层析和SP琼脂糖离子交 换层析，纯化人重组透明质酸酶。
[0052] 层析：用IOmM Tris+50mM NaCl pH7. 5缓冲液冲洗10个柱体积，将人重