一种基于活性筛选的牡丹皮药材及制剂检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种基于活性筛选的牡丹皮药材及制剂检测方法，属于中医药研宄方 法学领域。
【背景技术】
[0002] 目前国内外中药药材、中间体、制剂质量控制的方法是在化学成分研宄的基础上， 建立中药中的某一或两个有效成分（主成分）的定性、定量分析方法，进而控制中药的质 量。但这种质量控制方法未能体现中药整体特点，也未能给出这些质控指标与药效相关的 证据，更值得关注的是这些成分的质量控制不是越高越好，而是不同的成分应该控制在一 定范围比例内，即"组分结构"。很多研宄案例结果显示中药（复方）的最佳药效是多种药 材或组分之间组成结构的生物学反映。
[0003] 牡丹皮为双子叶植物，是毛茛科植物牡丹PaeoniasuffruticosaAndr.的干燥的 根皮。产于安徽、四川、河南、山东等地。牡丹皮始载于《神农本草经》，列为中品，具有清热 凉血、活血化淤、退虚热等功效。现代学者对牡丹皮的化学成分进行了许多药理效应研宄， 认为其具有心血管系统作用、保肝、降血糖、降血脂、降血压等作用，还具有中枢神经系统作 用。对牡丹皮及其产品的质量控制，2010年《中国药典》质量控制标准规定药材含丹皮酚不 得少于1. 2%，该质控标准不能客观准确反应牡丹皮的药材质量。在《中国药典》中收录的 近40种成方制剂，对于牡丹皮药材来说，质控指标仅一个或不涉及。
[0004] 本技术基于活性成分的筛选，结合主成分分析、聚类分析等手段，揭示了牡丹皮药 材、中间体、制剂的组成结构特征，确定多成分指标的质控范围，为牡丹皮药材及制剂提供 一种多组分质量控制方法。
【附图说明】
[0005] 图1肾系膜细胞固相化牡丹皮提取物产物色谱图（A)及化学结构图（B)，其中（a) 牡丹皮孵育液；(b)最后一次PBS洗涤液；（c)空白解离液；（d)固相化产物解离液
[0006] 图2牡丹皮提取物抑制AGES生成色谱图（A)及化学结构图（B)，其中（a)牡丹皮 孵育液；(b)丙酮醛孵育液；（c)牡丹皮与丙酮醛孵育液
[0007]图3牡丹皮提取物抑制血小板聚集生成色谱图（A)及化学结构图（B)，其中（a)牡 丹皮孵育液；(b)最后一次PBS洗涤液；（c)空白解离液；（d)固相化产物解离液
[0008] 图4HPLC法测定的不同产地牡丹皮（A)及成分聚类分析结果（B)，注：从前向后依 次为湖南、安徽、甘肃、重庆、四川、贵州、河南、河北、浙江、山东产地的牡丹皮吸收峰。
[0009] 图5效应物质对AGES诱导的SOD活性（A)及MDA含量⑶的影响
[0010] 图6效应物质系膜细胞FN蛋白表达的影响
[0011] 图7效应物质血管内皮细胞凋亡的影响，其中：a，200yg/mL牛血清白蛋白；b，200yg/mLAGEs;c,氨基胍（10yM) +200yg/mLAGEs;d,丹皮酚pae(10-4M) +200yg/ mLAGEs;e,三没食子酰葡萄糖（10-4M)+200yg/mLAGEs;f,五没食子酰葡萄 糖（10-4M)+200yg/mLAGEs;g,芍药苷（10-4M)+200yg/mLAGEs;h,氧化芍药苷 (10-4M) +200yg/mLAGEs;i,苯甲酰芍药苷（10-4M) +200yg/mLAGEs.AGEs组和BSA组相 比，###p〈〇. 〇〇l;样品组与AGEs组相比，*P〈0. 05, #P〈0. 01, *#P〈0. 001。
[0012] 图8牡丹皮药材、中间体、配方颗粒6个有效成分HPLC色谱图
[0013] 图9不同产地牡丹皮对肾系膜细胞ICAM-1、TGF-M和FN表达的影响及药效聚类 分析
【发明内容】
[0014] 解决的技术问题：
[0015] 本发明针对牡丹皮药材、中间体及制剂产品的质量检测现状，提供一种基于高效 液相色谱法的牡丹皮药材、中间体及制剂产品质量检测方法，通过主成分分析和聚类分析 统计方法，获得主要的质控指标，并经药理活性评估证明其有效，确定指标成分的控制范 围，为一种基于活性筛选的牡丹皮药材及制剂检测方法。
[0016] 技术方案：
[0017] 基于中医药整体性特点，采用现代活性成分筛选技术筛选牡丹皮药材中多个活性 成分，结合数理统计聚类分析和主成分分析，确定与药效相关的6个主要成分，经抗AGEs 诱导的肾系膜细胞和血管内皮细胞的活性评估，并确定这些成分的组成结构特征及检测范 围，对其药材、中间体、制剂产品进行质量检测。
[0018] 本发明提供的一种基于活性筛选的牡丹皮药材及制剂检测方法，其主要包括以下 步骤：
[0019] (1)采用细胞膜固相色谱技术和糖基化产物共孵育体系筛选与血小板、肾系膜细 胞、抑制糖基化产物生成的成分，并对这些成分进行辨识和解析，确定13个成分。
[0020] (2)根据步骤（1)采取聚类分析根据成分进行聚类分析，并采用主成分分析确定6 个与药效活性相关的主成分。
[0021] (3)根据步骤⑵中确定的6个活性成分，评价其对抗糖基化产物AGES对肾系膜 细胞和血管内皮细胞损伤的保护活性。
[0022] (4)根据步骤⑵和⑶中确定的6个活性成分，建立检测牡丹皮药材、中间体及 制剂的HPLC条件：
[0023] a.液相色谱条件：色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：乙腈 (A)-0? 1 % 甲酸水溶液（B)，梯度洗脱条件：0-20min，5 % -10 %A;20-30min，10 % -10 %A; 30-80min，10 % -18 %A;80-120min，18 % -50 %A;检测波长 254nm，流速 0? 8mL/min，柱温 25 °C。
[0024] b.对照品溶液的制备：分别精密称取恒重的对照品氧化芍药苷、芍药苷、三没食 子酰葡萄糖、五没食子酰葡萄糖、苯甲酰芍药苷和丹皮酚适量，加60%甲醇溶液分别制成每 lmL含芍药苷72. 15yg、氧化芍药苷59. 56yg、三没食子酰葡萄糖89. 35yg、五没食子酰葡 萄糖109. 76yg、苯甲酰芍药苷137. 67yg和丹皮酚86. 23yg，用甲醇定容至刻度，摇匀；另 各取lmL配成混合对照品溶液。
[0025] c.供试品溶液的制备
[0026]牡丹皮药材供试品溶液的制备：精密称定牡丹皮药材粉末约0. 5g，置50mL容量瓶 中，加75%乙醇（v/v)20mL，超声或回流处理30min(两次），取出，放冷，合并滤液，加75% 乙醇定容至50mL刻度，摇匀，经0. 45ym的微孔滤膜滤过，即得；
[0027] 牡丹皮提取物供试品溶液的制备：精密称定牡丹皮提取物0.lg，置50mL容量瓶 中，加75%乙醇（v/v)20mL，超声或回流处理30min(两次），取出，放冷，合并滤液，加75% 乙醇定容至50mL刻度，摇匀，经0. 45ym的微孔滤膜滤过，即得；
[0028] 牡丹皮制剂供试品溶液的制备：精密称定牡丹皮制剂粉末约0. 25g，置50mL容 量瓶中，加75%乙醇（v/v) 20mL，超声或回流处理30min(两次），取出，放冷，合并滤液，加 75%乙醇定容至50mL刻度，摇匀，经0. 45ym的微孔滤膜滤过，即得；
[0029] d.测定法：高效液相色谱仪分析对照品和供试品溶液，进样体积10yL。
[0030] (5)根据步骤（4)中建立的HPLC检测方法，结合药效分析和聚类分析，确定质量检 测范围。
[0031] 有益效果：针对牡丹皮药材、中间体及制剂产品的质量检测缺点，本发明基于活性 筛选，结合数理统计方法，确定主成分，利用高效液相色谱同步检测技术，建立氧化芍药苷、 芍药苷、三没食子酰葡萄糖、五没食子酰葡萄糖、苯甲酰芍药苷和丹皮酚含量同步测定方 法，并确定最佳控制范围，进一步保证牡丹皮药材药材、中间体、制剂产品的质