一种梨果皮中木质素单体含量的测定方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种梨果皮中木质素单体含量的测定方法。
【背景技术】
[0002]木质素分为由紫丁香基丙烷结构单体聚合而成的紫丁香基木质素(S-木质素)、由愈创木基丙烷结构单体聚合而成的愈创木基木质素(G-木质素)及由对一羟基苄基丙烷结构单体聚合而成的对一羟基苯基木质素(H-木质素)等三种类型。包含梨在内的被子植物中多为物种中仅存在S-木质素和G-木质素。
[0003]梨果皮色泽是果品经济价值的重要指标。研宄表明，梨果皮褐色形成与木质素合成关系密切，随着相关酶PPO和POD活性的降低，木质素合成量减少而明显降低，并且在木质素生物合成途径中S-和G-木质素单体的形成分别受不同基因的调控。因此，为了深入研宄褐皮梨果皮中S-和G-木质素单体形成机理，需要建立一种准确、快速的方法来测定果皮中木质素单体的含量，为进一步调控梨果皮色泽奠定理论基础。
[0004]目前，对于木质素含量的测定方法主要有酸解法、巯基乙酸法和乙酰溴法等，但这些方法都是针对测定总木质素含量，不能对木质素单体进行分离、测定。而对于木质素单体，目前仅有中药丹参根中木质素单体含量的测定见于报道，在梨果皮中木质素单体含量测定方面，缺少一种行之有效，简便准确的测定方法。
【发明内容】
[0005]为了解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种适用测定梨果皮中木质素单体含量的方法。
[0006]为实现上述目的，本发明采用如下技术方案:
[0007]本发明提供了一种测定梨果皮中木质素单体含量的方法，该方法包括如下步骤:
[0008]取样品用液氮研磨，经有机相和热水提取后，烘干，然后采用三氟化硼和乙硫醇提取，再加入内标正二十二烷，再烘干后用嘧啶和N，O-双三甲基硅基乙酰胺衍生化，用气相色谱-质谱联用仪分析。
[0009]上述测定梨果皮中木质素单体含量的方法的步骤，可优化为:
[0010]I)液氮研磨样品，有机溶剂初提，热水提取，烘干；
[0011]2)置于反应液中反应；
[0012]3)离心取上清，加入正二十二烷、水和二氯甲烷涡旋静置分层；
[0013]4)有机相提取后烘干；
[0014]5)得到的烘干物质重新溶于二氯甲烷，加入嘧啶和N，O-双三甲基硅基乙酰胺，静置后用气相色谱-质谱联用仪分析。
[0015]进一步，测定梨果皮中木质素单体含量的方法的步骤优化为:1)液氮研磨样品，分别用丙酮、甲醇各提取，再用热水提取，烘干；
[0016]2)按照一定的质量体积比，将烘干后的样品加入反应液中，置恒温烘箱反应；
[0017]3)离心取上清，加入溶于二氯甲烷的正二十二烷，用碳酸氢钠调PH为3?4，加超纯水和二氯甲烷，涡旋，静置分层；
[0018]4)吸取下层有机相，于恒温烘箱中烘干；
[0019]5)得到的烘干物质重新溶于二氯甲烷，加入嘧啶和N，O-双三甲基硅基乙酰胺，静置后用气相色谱-质谱联用仪分析。
[0020]更进一步，上述测定梨果皮中木质素单体含量的方法的步骤优化为:
[0021]I)液氮研磨样品，分别用丙酮、甲醇各提取，再用热水提取，45°C烘干；
[0022]2)按照质量体积比为50:1，将烘干后的样品加入反应液中，置100°C恒温烘箱反应4h，再置于_20°C停止反应；
[0023]3) 12000rpm离心lOmin，取上清液，按照样品与溶于二氯甲烷的正二十二烷的体积比3:2，加入正二十二烧，用碳酸氢钠调PH为3?4，加2mL超纯水和ImL 二氯甲烧，涡旋，静置分层；
[0024]4)吸取下层有机相500 μ L，于45°C恒温烘箱中烘干；
[0025]5)得到的烘干物质重新溶于二氯甲烷，加入嘧啶和N，O-双三甲基硅基乙酰胺，静置后用气相色谱-质谱联用仪分析。
[0026]其中，上述步骤2)中所述的反应液是通过将终浓度为2.5%的三氟化硼乙醚和10%的乙硫醇溶于二氧六环制得的。
[0027]其中，所述气相色谱-质谱联用仪的分析条件为:进样口温度为240?260°C，电子轰击离子源温度为220?240°C，接口温度270?290°C ;溶剂出峰时间延迟3?4min。
[0028]进一步地，所述气相色谱-质谱联用仪的分析条件为:进样口温度为250°C，电子轰击离子源温度为230°C，接口温度280°C ;溶剂出峰时间延迟3min。
[0029]上述测定梨果皮中木质素单体含量的方法还包括如下步骤:根据分子离子峰来定性，其中质荷比269为G木质素单体，荷质比299为S木质素单体。
[0030]上述测定梨果皮中木质素单体含量的方法还包括以下步骤:根据正二十二烷的浓度，峰面积，气相响应因子k来定量，从而计算出样品中两种木质素单体的含量。
[0031]其中，上述的响应因子k为1.5。
[0032]本发明在处理样品时采用液氮研磨，可有效的降低样品褐变，酶失活对测定结果的影响；在检测样品时，本发明是采用正二十二烷作为内标物，出峰时间早且稳定，定量更加准确。此外，本发明提供的详细的处理方法，合适的气相色谱-质谱联用仪分析(GC-MS)条件，可以简便，快速，准确的测定梨果皮的2种木质素单体的含量，从而为研宄果皮中木质素单体对果皮色泽的影响提供依据，进而为进一步调控梨果皮色泽奠定理论基础。
【附图说明】
[0033]图1是两种梨果皮中木质素单体的定性鉴定图；以及
[0034]图2是砀山酥梨和锈酥梨的果皮内两种木质素单体含量的对比结果图。
【具体实施方式】
[0035]以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。
[0036]实施例
[0037]I仪器与样品
[0038]1.1 仪器:安捷伦 7890A GC system 串联 5975C inert XL MSD。色谱柱:安捷伦HP-5，30111*0.25mm*0.25 μ mD
[0039]1.2样品:‘砀山酥梨’及其褐皮芽变品系‘锈酥’的果皮。
[0040]2方法与结果
[0041]2.1样品的处理:取上述样品的各Imm左右厚度的梨果皮，采用液氮研磨，分别用丙酮、甲醇各提取24h，