马兰活性组分及化合物及制备和应用
【专利摘要】本发明提供一种马兰水溶性活性组分及两个黄酮苷化合物，将中药马兰粉碎后，甲醇浸提，抽滤浓缩，经水和乙酸乙酯溶剂分配后，水层浓缩，先经ODS开口柱分离，再通过硅胶开口柱分离得到马兰活性组分，再纯化得到两个黄酮苷化合物。本发明通过抑制疫霉孢子囊产生的生物活性系统，发现马兰活性组分和其中两个黄酮苷类化合物能显著抑制疫霉孢子囊的产生，发挥抗疫霉作用，可在制备抗疫霉菌农药中应用。本发明制备方法简单，提取的产物纯度高，且马兰为便宜易得的蔬菜和中药，扩展了马兰的药物用途，为利用传统中药材开发创新农药提供了依据。
【专利说明】
马兰活性组分及化合物及制备和应用
技术领域
[0001] 本发明属医药技术领域，设及马兰水溶性活性组分及化合物，W及制备方法和在 制备抗疫霉病农药中的应用。
【背景技术】
[0002] 目前，疫霉菌已经超过100种，并在逐月增加，能引起世界上最具有毁灭性的植物 病害，每年都带来严重的经济损失。19世纪中叶，致病疫霉引起的马铃馨晚疫病导致了爱尔 兰大饥荒的发生，最终造成一百多万人死亡，一百多万人背井离乡的人间悲剧。由精疫霉引 起的按树根腐病使澳大利亚西南地区的森林结构和植物种群发生了重大变化，运已经严重 威胁到当地的生物多样性和自然生态系统。化学农药长期而广泛的应用也产生了严重耐药 性和环境污染。因此，寻找和发现低毒高效的抗疫霉菌活性物质已成为急需解决的问题。
[0003] 目前抗疫霉菌活性物质的研究主要集中在抑制菌丝生长和游动抱子萌发两方面， 对具有抑制疫霉菌无性生殖阶段抱子囊产生的活性物质的研究极少，而抱子囊的产生是疫 霉菌无性生殖阶段的关键时期，其产生的游动抱子是疫霉菌蔓延的基础。因此寻找具有抑 制无性抱子囊产生的活性物质具有及其重要的意义。
[0004] 天然产物作为药物拥有取材天然，来源广泛;作用平稳;毒副作用相对较小;是药 物先导物的最佳来源之一等的特点，因而被广泛研究。另外，我国中药资源十分丰富，很多 中药都拥有悠久的应用历史，因此从中药中寻找具有抗疫霉菌活性的成分有较大的优势。
[0005] 马兰化alimeris indica)属于菊科马兰属，多年生草本植物，又名路边菊。在我 国，其作为中药用于治疗感冒、腹泻、胃溃瘍、急性胃脈肿、胃肠炎、急性睾丸炎、吐血和损伤 等疾病。主要化学成分有酪类、祗类、多糖、挥发油等。具有众多的生物活性，一直被广泛研 究。例如：马兰在制备降血脂药物或功能性食品中的应用；治疗流行性腮腺炎的苍耳马兰 汤;一种用于治疗持的马兰汤等。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种马兰水溶性活性组分及其中两个黄酬巧化合物，所述的 马兰水溶性活性组分及其中两个黄酬巧化合物通过W下制备步骤实现：
[0007] (1)马兰经粉碎后用甲醇浸提，抽滤浓缩后再经水和乙酸乙醋溶剂分配、水层浓 缩，得到浸提物；
[000引（2)将所得浸提物依次经ODS和硅胶开口柱分离，得到马兰抑制疫霉抱子囊产生的 活性组分；
[0009] (3)所得马兰活性组分经HPLC纯化后得两个黄酬巧化合物：kaempferol-3-0- rutinoside和isorhamnetin-3-〇-rutinoside。
[0010] 步骤(1)中所用马兰为干燥的马兰全株。
[0011] 步骤(2)中ODS(十八烷基硅烷键合硅胶填料)开口柱分离的溶剂系统为甲醇：水： 溶剂系统按体积比为甲醇:水= 3:7,5:5,6:4,7:3,8:2,9:1，10:0。
[0012]步骤(2)中硅胶开口柱分离的溶剂系统为乙酸乙醋：甲醇= 7:3,5:5,3:7,0:10。 [OOU] 步骤(3)中HPLC纯化的色谱条件：色谱柱C18(巫10/250mm)，流速3mL/min，检测波 长210nm，流动相为为甲醇:水= 35:65。
[0014] 两个黄酬巧化合物kaempfe;rol-3-0-;rutinoside和iso;rhamnetin-3-0- rutinoside在马兰水溶性活性组分中的含量在51%~72%之间。结构式如下：
[0015]
[0016] 本发明的另一个目的是提供所述的马兰水溶性活性组分及两个黄酬巧化合物在 制备抗疫霉菌农药中的应用。所述农药由马兰水溶性活性组分及两个黄酬巧化合物与农药 学上可接受的载体组成。本发明研究表明马兰水溶性活性组分及其中两个黄酬巧化合物可 W显著地抑制疫霉抱子囊的产生。
[0017] 本发明的药物剂型选用选用粉剂、乳剂或颗粒剂等。
[0018] 本发明通过抑制疫霉抱子囊产生的生物活性系统，发现马兰活性组分和其中两个 黄酬巧类化合物能显著抑制疫霉抱子囊的产生，发挥抗疫霉作用，可在制备抗疫霉菌农药 中应用。本发明制备方法简单，提取的产物纯度高，且马兰为便宜易得的蔬菜和中药，扩展 了马兰的药物用途，为利用传统中药材开发创新农药提供了参考。本发明制备方法简单，提 取的产物纯度高，且马兰为便宜易得的中药，为利用传统中药材开发创新农药提供了依据。
【附图说明】
[0019] 图1是马兰水溶性棘性组分对疫霉菌抱子囊产生的抑审峰。
[0020] 图 2是化合物4日61119'61'〇1-3-〇-1'111：；[]1031(16和1301'11日1]1]161：；[]1-3-〇-1'111：；[]1031(16对疫 霉菌抱子囊产生的抑制率，其中左：kaempferol-S-O-rutinoside，右：iso;rhamnetin-3-〇- rutinoside。
[0021 ]图 3是化合物4日61119'61'〇1-3-〇-1'111：；[]1031(16和1301'11日1]1]161：；[]1-3-〇-1'111：；[]1031(16抑制 疫霉菌抱子囊产生的显微图片。图中a为阴性对照:0.2%DMS0，b为阳性对照：甲霜灵(3化g/ 111]^)，。为1<：日61119'61'〇1-3-〇-1'111：；[]1031(16(3〇11]\〇(1,1<：日61119'61'〇1-3-〇-1'111：；[]1031(16(3〇11]\〇。
【具体实施方式】
[0022] W下结合附图和实施例对本发明作进一步的说明。但不应将此理解为本发明上述 主题的范围仅限于下述的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范 围。
[0023] 实施例1马兰水溶性活性组分及其中两个黄酬巧化合物kaempf ero 1-3-0- rutinoside 和 isorhamnetin-3-O-rutinoside 的审 Ij 备方法
[0024] (I)粉碎和浸提：
[0025] 取Ikg干燥的马兰粉碎后，用IOL甲醇（工业级）室溫下浸提2次，每次1天，抽滤浓 缩，得甲醇浸提物粗样，用乙酸乙醋和水萃取分离，静置，将水层减压浓缩旋干后，得到乙水 层粗样2始。
[0026] (2)分离和纯化：
[0027] 将水层粗样先经ODS开口柱分离(溶剂系统按体积比为甲醇:水=3:7，5:5，6:4，7: 3,8:2,9:1，10:0);活性样品再用硅胶开口柱分离（200-300目，^下溶剂系统按体积比，乙 酸乙醋：甲醇= 7:3,5 :5,3:7，0:10);得到黄色的含活性化合物的活性组分（152mg)。取 17.4mg活性组分用反向HPLC纯化，色谱条件:色谱柱C18(〇10/250mm)，流速3ml/min，检测 波长210皿，流动相为为甲醇：水=35:65，得到4曰61119'61'〇]_-3-0-1'111:;[]1〇31(16(4.1111旨,保留时 间为60.0111；[]1)和13〇1'11日1]1]161:;[]1-3-0-1'111:;[]1〇31(16(4.8111邑,保留时间为69.7111；[]1)。
[0028] 实施例2
[00 巧]对实施例 1 所得化合物kaempf 61'〇1-3-0-1'111:;[]1〇31(16和13〇1'11日1]1]161:;[]1-3-0- rutinoside的理化特征及化学结构的定性鉴定：
[0030]化合物 4日61119'61'〇1-3-0-1'111：；[]1〇31(16和13〇1'11日1]1]161：；[]1-3-0-1'111：；[]1〇31(16的结构经 Ih NMR、MS和文献比对确定
[0031 ] 化合物kaempferol-S-O-rutinoside的理化性质：黄色固体， [a],:- i 6.2。（(' 0.2, McOH),分子式为C2讯3〇〇15; ESI-TOF-MS :m/z 595.1663(M+H) +，氨谱数据： Ih NMR( 500MHz，CD3孤）：5 = 1.12(3H，d，J = 6. OHz，H-护 '），3.25-2.81 (IOH，m，H-2"-护/T'- 5"'），4.51(lH，s，H-r'），5.12(lH，d，J = 7.5Hz，H-r)，6.89(2H，d，J = 8.5Hz，H-375'）， 8.07(2H，d，J = 8.甜z，H-276'），6.41(lH，s，H-8)，6.21(lH，s，H-6)。
[0032] 化合物isorhamnetin-S-O-rutinoside的理化性质：黄色固体， [CtE-%.4。（(' 0.07, Mt'OH)，分子式为C2祖32016，ESI-TOF-MS:m/z 625.1765(M+H) +，氨谱数据 :Ih NMR( 500MHz，CD3孤）：5 = 1.09 (3H，d，J = 6. OHz，H-6"'），3.22-3.49(8H，m，H-2"-5"/T'- 5，，，），3.60(lH，dd J = 3.5,2.0Hz，H-6b，，），3.81(lH，dd J=12.5，1.5Hz，H-6a，，），4.52(lH, d J=l.甜z，H-^'），5.24(lH，dJ = 7.0Hz，H-^)，7.62aH，ddJ = 8.5,2.0Hz，H-6'），6.91 化，d，J = 8.5Hz，H-5'），7.94( lH，d，J = 2.0Hz，H-2'），3.94(3H, S，-0C 曲），6.40( lH，d, J = 2.0Hz)，6.20(lH，d，J = 2.0Hz)。
[0033] 实施例3
[0034] 马兰水溶性活性组分及化合物在辣椒疫霉筛选模型中，能显著抑制疫霉菌抱子囊 的产生。
[0035] 目前抗疫霉菌活性物质的研究主要集中在抑制菌丝生长和游动抱子萌发两方面， 对具有抑制疫霉菌无性生殖阶段抱子囊产生的活性物质的研究极少。甲霜灵是目前在防治 植物疫病上面被最广泛应用的一种农药，可强烈抑制疫霉菌丝体的生长和无性抱子囊的产 生。本发明发现马兰水溶性活性组分及其中两个黄酬巧化合物kaempferol-3-O- rutinoside和isorhamnetin-S-O-rutinoside在辣椒疫霉模型中，显著抑制疫霉菌抱子囊 的产生。
[0036] 1.实验方法：
[0037] (1)从l〇°C生化培养箱取出辣椒疫霉菌株，复苏到25°C，取一小块接种到20ml固体 培养皿（10%的V8化ice，0.02%的碳酸巧，2%的琼脂粉）中。25°C避光培养3-4d备用。
[003引 （2)取￥8化;[。6 50111]^，碳酸巧0.2邑,于离屯、管中混匀，离屯、15111；[]1(400〇1'/111；[]1)，得到 VSjuice上清液。
[0039] (3)取出在生化培养箱中避光培养3-4d的固体平板，用打孔器在菌丝边缘切下直 径为6mm的菌块，放在已灭菌的直径为6cm的培养皿中屯、，然后加入IOmL液体培养基（3%的 V8 juice上清液），放于25°C生化培养箱避光培养。4化后，除去培养基，并加入IOmL无菌水/ 皿。样品加入时，先将样品别用20化DMSO溶解，然后用移液枪吸取培养皿中的无菌水98化 L，加入到样品溶液中，混匀后再均匀加入到培养皿中。测定中WO. 2%DMS0为阴性对照，W 30yg/血的甲霜灵为阳性对照。经过16-24h的避光培养，在光学显微镜下观察疫霉菌无性抱 子囊产生的情况并悬浮计数(10倍目镜，4倍物镜)统计，然后计算其抑制率。
[0040] 抑制率（％) = (Nd-Ns)/NdX100%
[0041] Nd:阴性对照组单位体积内产生的无性抱子囊数;Ns:样品组单位体积内产生的无 性抱子囊数。
[0042] 2.实验结果：
[0043] 马兰活性组分在30yg/mL对疫霉菌抱子囊产生的具有明显的抑制作用（图1)。化合 物 4日6111口'61'〇1-3-0-1'111：；[]1〇31(16和13〇1'11日1]1]161：；[]1-3-0-1'111：；[]1〇31(16在3-30111的浓度范围内 对疫霉菌抱子囊的产生具有抑制作用（图2)。运两种化合物在浓度为30iiM时，对疫霉菌抱子 囊抑制率分别为92%和83%，相应显微图片（图3)。
【主权项】
1. 一种马兰水溶性活性组分及二个两个黄酮苷化合物，其特征在于，通过以下方法获 得： (1) 马兰经粉碎后用甲醇浸提，抽滤浓缩后再经水和乙酸乙酯溶剂分配、水层浓缩，得 到水层粗样； (2) 将所得水层粗样依次经ODS和硅胶开口柱分离，得到马兰抑制疫霉孢子囊产生的活 性组分； (3) 所得马兰活性组分经HPLC纯化后得两个黄酮苷化合物：kaempfer〇l-3-0-rutinoside 和 isorhamnetin_3-〇-rutinoside，结构式如下：2. 根据权利要求1所述的一种马兰水溶性活性组分及二个两个黄酮苷化合物，其特征 在于，步骤(1)中所用马兰为干燥的马兰全株。3. 根据权利要求1所述的一种马兰水溶性活性组分及二个两个黄酮苷化合物，其特征 在于，步骤(2)0DS开口柱分离的溶剂系统为甲醇:水，溶剂系统按体积比为甲醇:水=3: 7， 5:5,6:4,7:3,8:2,9:1,10:0〇4. 根据权利要求1所述的一种马兰水溶性活性组分及二个两个黄酮苷化合物，其特征 在于，步骤(2)硅胶开口柱分离的溶剂系统为乙酸乙酯：甲醇，体积比为7 :3,5:5,3:7,0:10。5. 根据权利要求1所述的一种马兰水溶性活性组分及二个两个黄酮苷化合物，其特征 在于，步骤(3)中HPLC纯化的色谱条件为：色谱柱C18?10/250mm，流速3mL/min，检测波长 210nm，流动相为甲醇：水= 35:65。6. 根据权利要求1所述的一种马兰水溶性活性组分及二个两个黄酮苷化合物，其特征 在于，两个黄酮苷化合物 1<3611^^61'〇1-3-〇-1'111：；[1108丨(16和丨801'11&1]11161：；[11-3-〇-1'111：；[1108丨(16在 马兰水溶性活性组分中的含量在51 %~72 %之间。7. 权利要求1所述的马兰水溶性活性组分及二个两个黄酮苷化合物在制备抗疫霉菌农 药中的应用。8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述农药由马兰水溶性活性组分及两个黄 酮苷化合物与农药学上可接受的载体组成。9. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述农药的剂型选用粉剂、乳剂或颗粒剂。
【文档编号】C07H1/08GK105924479SQ201610463306
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年6月22日
【发明人】戚建华, 张慧, 王源超
【申请人】浙江大学