一种肿瘤靶向性藤黄酸类化合物及其制备方法和用图
【专利摘要】本发明属于天然药物领域，公开了一种肿瘤靶向性藤黄酸类化合物及其制备方法和用途。该化合物具有如式(I)所示的结构。其中，G为藤黄酸类化合物；P为低聚化乙二醇或其一端氨基化的衍生物；FA为叶酸或叶酸类似物；FA以酯键或酰胺键与P偶联，P以端羟基与G的羧基偶联。通过体外MTT检测实验，发现其对肿瘤细胞株(HeLa和HepG2细胞)具有更好的抑制效果，比藤黄酸类药物强4?10倍，但对正常肝细胞LO2的毒性低6倍以上。该叶酸修饰的藤黄酸类化合物具有叶酸受体介导靶向肿瘤细胞的特性，可克服藤黄酸类抗癌药物选择性低和易多耐药性的问题，达到通过细胞凋亡、诱导自噬等途径清除癌细胞的效果。G?P?FA(I)。
【专利说明】
一种肿瘤靶向性藤黄酸类化合物及其制备方法和用途
技术领域
[0001] 本发明属于天然药物领域，特别涉及一种肿瘤靶向性藤黄酸类化合物及其制备方 法和用途。
【背景技术】
[0002] 癌症是严重危害人类健康的一大顽症，现已成为仅次于心血管病的第二大杀手， 寻找抗癌药物和研究其作用机理，尤其是开发具有靶向肿瘤效应的药物，具有重要意义。
[0003] 总藤黄酸(含藤黄酸、新藤黄酸和别藤黄酸)是从藤黄分泌干燥树脂中提取分离获 得的藤黄酸类活性成分，据现有研究报道其具有优异的抗癌活性，但该类化合物的癌细胞 靶向选择性缺乏、水溶性差、毒性大等不足，严重限制了其在临床上的使用。
[0004] 叶酸受体（folate receptor,FR)是一种跨膜糖蛋白，主要有FR-α,-β，-γ三种亚 型，分子量较小，对叶酸及类似物有较高的亲和力(Kd = 0.1~ΙΟηΜ)，且具有饱和性、特异性 及可逆性等特点。现有研究报道FR在多种肿瘤细胞表面过度表达，如FR-α在超过90%的卵 巢癌、乳腺癌、子宫内膜癌、肝癌、肾癌、结肠癌及肺癌中高度表达，而FR-β主要在非上皮来 源的恶性肿瘤、粒细胞白血病和胰腺癌及关节炎活性巨噬细胞和肝脏炎症中高表达。FR-γ 则在一些造血细胞如恶性白血病中过度表达。在正常组织中高度保守，FR很少表达甚至不 表达，且与癌细胞表面的FR不同，呈极性分布，其与水溶液维生素 B家族中的叶酸(folate， folic acid，FA)及类似物的亲和力比肿瘤细胞表面的FR结合力弱很多，几乎不结合。FR可 以通过介导细胞内吞作用将FA及类似物，或FA缀合物由细胞外转运到细胞内发挥作用，且 于FA相对分子质量小、易于修饰和穿透癌细胞、免疫原性低，具有到达靶点时间短、血液清 除速度快、穿透力强、人体免疫反应低等优点。这为FR介导的肿瘤组织靶向成像和药物靶向 于癌症及风湿性关节炎(FR同样异常高表达)的治疗奠定了良好的基础。
[0005] 通过国内外文献和专利检索，尚未发现有叶酸类似物偶联藤黄酸类药物实现癌症 或风湿性关节炎的靶向给药方案先例。
【发明内容】
[0006] 为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种肿瘤靶向性藤 黄酸类化合物;该类化合物是通过叶酸修饰的藤黄酸类化合物。
[0007] 本发明的另一目的在于提供一种上述肿瘤靶向性藤黄酸类化合物的制备方法。
[0008] 本发明的再一目的在于提供上述肿瘤靶向性藤黄酸类化合物的用途。
[0009] 本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0010] -种肿瘤靶向性藤黄酸类化合物，该化合物具有如式(I)所示的结构：
[0011] G-P-FA
[0012] (I)
[0013] 其中，G为藤黄酸类化合物；
[0014] P为HOCH2 (CH2OCH2) nCH2〇H 或 HOCH2 (CH2OCH2) nCH2NH2，其中 η为0 或 1 ~10之间的自然 数；
[0015] FA为叶酸或叶酸类似物，优选叶酸；
[0016] 所述FA以酯键或酰胺键与P偶联，P以端羟基与G的羧基偶联。
[0017] 所述藤黄酸类化合物为藤黄酸、新藤黄酸、别藤黄酸、藤黄新酸或它们的混合物。 藤黄酸、新藤黄酸、别藤黄酸和藤黄新酸的混合物可以称为总藤黄酸。
[0018] 藤黄酸(Gambogic acid，GA)的化学式为：
[0019]
[0020] 新滕黄酸（Gambogenic acid，NGA)的化学式为：
[0021]
[0022] 别藤黄酸(Allogambogic acid，AA)的化学式为：
[0023]
[0024] 所述P的平均分子量为61~600。
[0025] 所述 P 的优选分子量 61、62、105、106、149、150、237、238、281、282、325、326、413、 414、501 或 502,记为 P61、P62、P105、P106、P149、P150、P237、P238、P281、P282、P325、P326、 P413、P414、P501或P502。
[0026] 所述叶酸类似物是可与P上NH2或0H偶联的叶酸类似生物，优选为5-甲基四氢叶 酸、5-甲酰基四氢叶酸、甲氨蝶呤或5,10-亚甲基四氢叶酸。
[0027] 上述肿瘤靶向性藤黄酸类化合物的制备方法，包括以下操作步骤：
[0028] (1)取叶酸溶于a溶剂中，在脱水剂N，N'_二环己基碳二亚胺或1-(3-二甲氨基丙 基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，以及催化剂对二甲氨基吡啶作用下，0°C搅拌反应1~6h;然后 与叶酸等摩尔比加入低聚化乙二醇，从冰浴中升高温度至室温，避光搅拌过夜;过滤除副产 物，滤液浓缩，冰乙醚沉淀重结晶或制备液相纯化，冻干即得叶酸偶联低聚化乙二醇；
[0029] 或取叶酸及类似物的活性酯溶解于无水DMS0/TEA中，加入与叶酸活性酯等摩尔的 低聚化乙二醇一端氨基化的衍生物，无水条件下反应过夜，真空冻干分离或色谱纯化，即得 叶酸偶联低聚化乙二醇氨基化衍生物；
[0030] 所述低聚化乙二醇为HOCH2(CH2OCH2)nCH 2OH，所述低聚化乙二醇一端氨基化的衍生 物为H0CH2 (CH2OCH2) nCH2NH2)，其中η为0或1~10之间的自然数；
[0031] (2)将藤黄酸类化合物溶于a溶剂中，在脱水剂Ν，Ν'_二环己基碳二亚胺或1-(3-二 甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，以及催化剂对二甲氨基吡啶作用下，0°C搅拌反应1 ~6h;然后按藤黄酸类化合物摩尔比1:1-3的量加入步骤(1)所得叶酸偶联低聚化乙二醇或 叶酸偶联低聚化乙二醇氨基化衍生物，从冰浴中升高温度至室温，避光搅拌过夜;过滤液浓 缩，冰乙醚或异丙醇重结晶，层析或制备液相纯化，冻干即可获得结构如式（I)所示的肿瘤 靶向性藤黄酸类化合物。
[0032] 步骤（1)所述a溶剂为CH2C12、DMS0或DMF;所述搅拌反应的时间为2.5h;所述室温为 25°C ;所述无水DMS0/TEA中DMS0和TEA的体积比为2:1;
[0033] 步骤⑵所述a溶剂为CH2C12、DMS0或DMF;所述搅拌反应的时间为2.5h;所述室温为 25。。。
[0034] 步骤（1)所述叶酸、脱水剂和催化剂的摩尔比为1:1:1~1: 30:30;步骤(2)所述藤 黄酸类化合物、脱水剂、催化剂的摩尔比为1:1:1~1:25:25。
[0035] 具有通式(I)结构的肿瘤靶向性藤黄酸类化合物的合成示意图如图1所示。
[0036] 上述肿瘤靶向性藤黄酸类化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗癌症疾病的 药物中的用途。
[0037] 所述药物中含有治疗有效量的肿瘤靶向性藤黄酸类化合物或其药学上可接受的 盐及药学上可接受的载体。
[0038] 所述药学上可接受的盐可以是：叶酸偶联的藤黄酸、新藤黄酸或别藤黄酸的化学 结构上酚羟基成钠、镁、钙盐或其他盐。
[0039]本发明的原理是：
[0040] 本发明基于叶酸受体介导肿瘤细胞靶向内吞原理，以叶酸修饰藤黄酸类化合物解 决藤黄酸类化合物的肿瘤靶向问题，同时叶酸和连接基团低聚合度的PEG衍生物（H0CH 2 (CH2OCH2) nCH20H 或 H0CH2 (CH2OCH2) nCH2NH2，MW 小于 600，其中 η = 0，1 ~10)具有很好的水溶 性、生物相容性和无免疫源性等优点，可以获得具有肿瘤靶向作用的叶酸偶联藤黄酸类药 物，提高药效，增加肿瘤细胞选择性，降低毒副作用，更适合抗癌临床使用。
[0041] 本发明的叶酸偶联藤黄酸类化合物技术制备工艺简单，藤黄酸类化合物的提取分 离纯化可参考相关文献来制备（陈葆仁，藤黄抗癌成分的研究I、藤黄酸的分离和结构的鉴 定。江西医学院学报1980;37(2): 1-7;吕归宝，杨秀贤，黄乔书。藤黄中新藤黄酸的分离及其 结构。药学学报 1984; 19(8) :636-639.)
[0042] 本发明人在设计和实验发明中发现通过水溶性分子叶酸化学修饰的藤黄酸类化 合物(含总藤黄酸、藤黄酸、新藤黄酸、别藤黄酸和藤黄新酸)具有更好的水溶性，显著增加 了肿瘤细胞选择性，提高了抗癌活性，大大降低了原型药物的毒性，与藤黄酸钠盐比较(小 鼠腹腔注射的LD5Q = 38.8mg/kg)，部分叶酸修饰藤黄酸类药物的LD5Q显著增加(G-P62-FA， G-P106-FA，G-P150-FA 和 G-P238-FA的小鼠腹腔注射 LD5Q 分别为 75.12、74.6、81.21和 92.4mg/kg，以藤黄酸值换算）。
[0043] 2 %兔红细胞溶血试验表明本发明的叶酸修饰的藤黄酸类化合物在4h内未见红细 胞溶血聚集，等价藤黄酸剂量>20mg。家兔耳缘静脉刺激性实验表明本发明的叶酸修饰藤黄 酸类化合物溶解在生理盐水中静脉滴注无血管刺激性。
[0044] 经过细胞毒实验MTT法测试表明，本发明化合物对具有叶酸受体阳性表达的肿瘤 细胞（宫颈癌HeLa和肝癌HepG2等)体外生长抑制作用IC 5Q比原型药物(藤黄酸为例）显著提 高4-10倍。对正常肝脏细胞L02毒性数据表明本发明化合物比原型药物对非癌细胞具有大 于6倍的IC 5Q值，提示叶酸修饰藤黄酸类药物具有更低的毒性和更好的肿瘤靶向性。溶解度 实验表明，与原型相比（藤黄酸不溶于水，报道约〇.〇18mg/ml)，叶酸修饰后的藤黄酸类化合 物水溶性明显提高(约为1.4-20mg/ml)，对药物剂型制备及血管给药等更加方便。
[0045] 在癌细胞靶向分子叶酸的介导驱动下，本发明的叶酸偶联藤黄酸类药物在机体内 可以很快进入叶酸受体高表达的肿瘤细胞;优选的短链乙二醇及其衍生物连接桥可改善药 物水溶性，同时又可以降低偶联物分子大小从而提高其癌组织穿透性。
[0046] 与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果:通过体外MTT检测实验，发现 其对肿瘤细胞株(HeLa和HepG2细胞)具有更好好的抑制效果，比藤黄酸类药物强4-10倍，但 对正常肝细胞L02的毒性低6倍以上。该叶酸修饰的藤黄酸类化合物具有叶酸受体介导靶向 肿瘤的特性，可克服藤黄酸类抗癌药物选择性低和易多耐药性的问题，达到通过细胞凋亡、 诱导自噬等途径清除癌细胞的效果。
【附图说明】
[0047] 图1为本发明具有通式（I)结构的肿瘤靶向性藤黄酸类化合物化合物的合成示意 图。
【具体实施方式】
[0048] 下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0049] 实施例1
[0050] 1)叶酸-乙二醇的制备:取叶酸（1.0g，2.3mmol)溶于40ml的DMS0中，在脱水剂(N， N ' -二环己基碳二亚胺，DCC，0 · 47g，2 · 3mmo 1)和催化剂（对二甲氨基吡啶，DMAP，0 · 29g， 2.3mmol)作用下，0°C搅拌4h;然后按叶酸等摩尔比加入乙二醇(HOCH2CH2OH)，从冰浴中升高 温度至室温25°C，避光搅拌过夜24h;过滤除副产物，滤液浓缩，冰乙醚沉淀重结晶或制备液 相纯化，冻干即得叶酸-乙二醇偶联产物(HOCH 2CH2OCO_FA)。
[0051 ] 2)叶酸-乙二醇-藤黄酸的制备：取藤黄酸(0.15mmol)溶于60ml的DMS0中，在脱水 剂DCC (3. Ommo 1)和催化剂DMAP (3. Ommo 1)作用下，0 °C搅拌6h;然后按藤黄酸摩尔比1:3倍加 入叶酸-乙二醇偶联产物(HOCH2CH2OCO_FA)，从冰浴中升高温度至室温25°C，避光搅拌过夜。 过滤液浓缩，冰乙醚或异丙醇重结晶，层析或制备液相纯化，冻干即可获得癌细胞靶向性藤 黄酸类化合物GA-COOCH 2CH2OCO_FA(收率约65% )。
[0052] 1顯1?(50010^，01^0):3.6和4.2左右为乙二醇上氢的峰，其他峰为藤黄酸和叶酸 上氢的峰；1.24-1.46(GA:C24-H，C25-H，6H)，1.56-2.16(GA:C19-H，C20-H，C21-H，C34-H， C35-H，C36-H，C39-H，C40-H，21H)，2·26-2·66(GA:C22-H，C26-H，C29-H，6H，FA:C27-H，2H)， 2.96(GA :C11-H，1H)，3.23(GA:C31-H，2H)，4.45-4.63(FA:C13-H，C24-H，3H)，5.27(GA:C37-H，1H)，5.84(GA :C32-H，1H)，6.04(GA:C3-H，1H)，6.71(GA:C27-H，1H)，6.84-6.92(GA:C4-H， (：10-!1，2!^厶 :苯环上(：16-!1，(：17-!1，2!1;)，7.61(卩厶:苯环上(：18-!1，(：19-!1，2!〇。
[0053] IR:红外光谱中明显增加了 1728CHT1的酯羰基峰，说明藤黄酸和叶酸通过乙二醇的 酯键连接上。
[0054] 实施例2
[0055] 1)叶酸-乙二醇282的制备：取叶酸（1.0g，2.3mmol)溶于40ml的DMS0中，在脱水剂 (DCC，0.47g，2.3mmol)和催化剂(DMAP，0.29g，2.3mmol)作用下，0 °C 搅拌 4h;然后按叶酸等 摩尔比加入乙二醇282(H0CH2(CH20CH2)5CH 20H)，从冰浴中升高温度至室温25°C，避光搅拌过 夜24h;过滤除副产物，滤液浓缩，冰乙醚沉淀重结晶或制备液相纯化，冻干即得叶酸-乙二 醇282偶联产物(HOCH2 (CH2OCH2) 5CH2OCO-FA)。
[0056] 2)叶酸-乙二醇282-藤黄酸的制备:取藤黄酸(0.15mmol)溶于60ml的DMS0中，在脱 水剂DCC( 3. Ommo 1)和催化剂DMAP (3. Ommo 1)作用下，0 °C搅拌6h;然后按藤黄酸摩尔比1:3倍 加入叶酸-乙二醇282偶联产物(H0CH2(CH20CH 2)5CH20C0-FA)，从冰浴中升高温度至室温25 °C，避光搅拌过夜;过滤液浓缩，冰乙醚或异丙醇重结晶，层析或制备液相纯化，冻干即可获 得癌细胞靶向性藤黄酸类化合物GA-C00CH 2 (CH2OCH2) 5CH20C0-FA。
[0057] 七匪以500MHz，DMS0): 3.6和4.2左右为乙二醇282上氢的强峰，其他峰为藤黄酸和 叶酸上氢的峰；1.24-1.46(6厶<24-!1，〇25-!1，6!〇，1.56-2.16(6厶 :(：19-!1，〇20-!1，〇21-!1，〇34-H，C35-H，C36-H，C39-H，C40-H，21H)，2·26-2·66(GA:C22-H，C26-H，C29-H，6H，FA:C27-H， 2H)，2.96(GA:C11-H，1H)，3.23(GA:C3卜H，2H)，4.45-4.63(FA:C13-H，C24-H，3H)，5.27(GA: C37-H，1H)，5.84(GA:C32-H，1H)，6.04(GA:C3-H，1H)，6.71(GA :C27-H，1H)，6.84-6.92(GA: 〇4-!1，(：10-!1，2!^厶:苯环上(：16-!1，(：17-!1，2!1 ;)，7.61(卩厶:苯环上(：18-!1，(：19-!1，2!〇。
[0058] IR:红外光谱中明显增加了 1727CHT1的酯羰基峰，说明藤黄酸和叶酸通过乙二醇 282以酯键连接上。
[0059] 实施例3
[0060] 1)叶酸活性酯（γ -NHS-FA)的制备:取叶酸（1.0g，2.3mmol)溶解于40ml无水DMS0 中，加入0.5ml TEA三乙胺混合并于无水环境下室温避光搅拌过夜；然后混合0.47g (2.31111]1〇1)的0(^和0.268(2.31]11]1〇1)順3，避光搅拌2411，过滤除去副产物二环己脲，低温真空 干燥除去DMS0和TEA，得到叶酸活性酯。
[0061] 2)叶酸-乙醇胺的制备：将真空干脆的叶酸活性酯溶解于1.5ml的无水DMS0/TEA (体积比2:1)混合溶液中，取与叶酸活性酯等摩尔的乙醇胺加入混合溶液中于无水条件下 反应过夜，真空干脆反应液即得叶酸偶联乙醇胺(hoch2ch2nhco-fa)。
[0062] 3)叶酸-乙醇胺-藤黄酸的制备：取藤黄酸(0.15mmol)溶于60ml的无水DMS0中，在 脱水剂DCC (3. Ommo 1)和催化剂DMAP (3. Ommo 1)作用下，0 °C搅拌6h;然后按藤黄酸摩尔比1:3 倍加入叶酸偶联乙醇胺(H0CH2CH2NHC0-FA)，从冰浴中升高温度至室温25 °C，避光搅拌过夜。 过滤液浓缩，冰乙醚或异丙醇重结晶，层析或制备液相纯化，冻干即可获得癌细胞靶向性藤 黄酸类化合物GA-COOCH2CH2NHCO-FA ο
[0063] hNMRGOOMHz，DMS0): 3.6和4.2左右为乙醇胺上2个-CH2-上氢的峰，其他峰为藤黄 酸和叶酸上氢的峰；1 · 24-1 · 46(GA: C24-H，C25-H，6H)，1 · 56-2 · 16(GA: C19-H，C20-H，C21-H， C34-H，C35-H，C36-H，C39-H，C40-H，21H)，2.26-2.66(GA:C22-H，C26-H，C29-H，6H，FA:C27-H，2H)，2.96(GA :C11-H，1H)，3.23(GA:C31-H，2H)，4.45-4.63(FA:C13-H，C24-H，3H)，5.27 (GA :C37-H，lH)，5.84(GA:C32-H，lH)，6.04(GA:C3-H，lH)，6.71(GA:C27-H，lH)，6.84-6.92 (GA:C4-H，C10-H，2H ;FA:苯环上C16-H，C17-H，2H;)，7.61(FA:苯环上C18-H，C19-H，2H)， 8.07(NH,宽峰）。
[0064] IR:红外光谱中明显增加了 1500-1650(^1的酰胺峰和1727CHT1的酯羰基峰，说明 藤黄酸和叶酸通过乙二醇胺的酰胺键和酯键连接上。
[0065] 实施例4
[0066] 1)叶酸-乙二醇的制备:取叶酸（1.0g，2.3mmol)溶于40ml的DMS0中，在脱水剂(N， N ' -二环己基碳二亚胺，DCC，0 · 47g，2 · 3mmo 1)和催化剂（对二甲氨基吡啶，DMAP，0 · 29g， 2.3mmol)作用下，0°C搅拌4h;然后按叶酸等摩尔比加入乙二醇(HOCH2CH 2OH)，从冰浴中升高 温度至室温25°C，避光搅拌过夜24h;过滤除副产物，滤液浓缩，冰乙醚沉淀重结晶或制备液 相纯化，冻干即得叶酸-乙二醇偶联产物(HOCH 2CH2OCO_FA)。
[0067] 2)叶酸-乙二醇-新藤黄酸的制备：取新藤黄酸(0.15mmol)溶于60ml的DMS0中，在 脱水剂DCC (3 · Ommo 1)和催化剂DMAP (3 · Ommo 1)作用下，0 °C搅拌6h;然后按新藤黄酸摩尔比 1:3倍加入叶酸-乙二醇偶联产物(HOCH2CH2OCO_FA)，从冰浴中升高温度至室温25°C，避光搅 拌过夜。过滤液浓缩，冰乙醚或异丙醇重结晶，层析或制备液相纯化，冻干即可获得癌细胞 靶向性藤黄酸类化合物NGA-COOCH 2CH2OCO_FA。
[0068] hNMRGOOMHz，DMS0): 3.6和4.2左右为乙二醇上氢的峰，其他峰为藤黄酸和叶酸 上氢的峰；1.24-1.46(GA:C24-H，C25-H，6H)，1.56-2.16(GA:C3-H，C19-H，C20-H，C21-H， C34-H，C35-H，C36-H，C39-H，C40-H，23H)，2.26-2.66(GA:C22-H，C26-H，C29-H，6H，FA:C27-H，2H)，2.96(GA :C11-H，1H)，3.23(GA:C31-H，2H)，4.45-4.63(FA:C13-H，C24-H，3H)，5.27 (GA :C37-H，1H)，5.84(GA:C32-H，1H)，6.71(GA:C27-H，1H)，6.84-6.92(GA :C10-H，1H;FA:苯 环上(：16-!1，(：17-!1，2!1;)，7.61(卩厶 :苯环上(：18-!1，(：19-!1，2!〇。
[0069] IR:红外光谱中明显增加了 1728CHT1的酯羰基峰，说明新藤黄酸和叶酸通过乙二醇 的酯键连接上。
[0070] 实施例5:肿瘤靶向性藤黄酸类化合物注射液的制备
[0071]取等量于藤黄酸20g的经由实施例1制备的肿瘤靶向性藤黄酸类化合物(GA-P62-FA)，溶解于注射用水中，加入氯化钠5.0g搅拌均匀，稀盐酸调节pH= 5.0，然后加入0.5 %的 注射用活性炭，60°C恒温30min，脱炭后，滤液加注射用水至1000ml，0.22μηι的无菌滤膜过 滤，2ml/支分装于玻璃曲颈安瓿中，熔封，100°C流通蒸汽湿热灭菌40min，然后贴标签保存。
[0072] 实施例6:肿瘤靶向性藤黄酸类化合物冻干粉针剂的制备
[0073] 取等量于新藤黄酸20g的经由实施例4制备的肿瘤靶向性藤黄酸类化合物粉末，加 入注射用葡萄糖粉末25g搅拌均勾，按40mg/瓶无菌分装于玻璃曲颈安瓿中，密封然后贴标 签保存。
[0074] 实施例7 :肿瘤靶向性藤黄酸类化合物的血管刺激性试验
[0075] 取用注射用水50ml稀释实施例1制备的肿瘤靶向性藤黄酸类化合物10mg，实验家 兔6只，随机3组，其中生理盐水作对照，给家兔左耳缘静脉滴注叶酸偶联藤黄酸注射液，右 耳缘静脉滴注同体积生理盐水，3h内滴注完成。滴注完成后取注射点下端lcm处的血管及 心、肝、脾、肺、胰腺、肾和脑组织进行固定福尔马林溶液，石蜡包埋切片，HE染色，数字病理 学分析评价。
[0076] 经观察给药后每日家兔的饮食、毛发、肛门、呼吸、中枢神经系统、四肢活动状态等 均正常，无中毒表现。至约48h左右，处死的动物，观察直肠粘膜光滑平整，无异常;其余留存 家兔逐日监测，无异常出现。到第七天处死动物，观察体重和参照《中药新药研究指南》对血 管刺激进行分级。家兔血管刺激性试验的病理组织学检查结果为耳廓、表皮无异常，真皮血 管内皮细胞无肿胀，毛细血管管壁无出血、坏死或炎性细胞浸润，软骨层、软骨细胞无增生 或坏死，软骨细胞排列整齐;肝脏、心肌组织、脑组织、肺部、肾脏和胰腺组织均无异常。但藤 黄酸类药物注射液的耳廓表皮明显异常，真皮血管内皮细胞肿胀，毛细血管管壁出血、坏死 或有炎性细胞浸润区。生理盐水对照组耳廓表皮无异常，真皮血管内皮细胞无肿胀，毛细血 管壁无出血、坏死或炎性细胞浸润，软骨细胞排列整齐，无增生或坏死，软骨层、软骨细胞无 增生或坏死。癌细胞靶向性藤黄酸类化合物药物组与生理盐水组在病理学组织上无明显差 异。
[0077]实施例8:细胞毒检测评价实验
[0078] GA和NGA及其叶酸偶联物(GA-P62-FA、GA-P282-FA、NGA-P62-FA)的体外抗癌效应 评价。鉴于藤黄酸类化合物是广谱抗癌细胞毒剂，本实施例中采用多种癌组织来源的叶酸 受体阳性表达的肿瘤细胞(HeLa、HepG2和SK-0V-3)对实施例1、2和4制备的相应偶联产物 GA-P62-FA、GA-P282-FA和NGA-P62-FA及其原型化合物GA和NGA进行药效评价，同时L02肝脏 细胞对其进行正常细胞的毒实验测试。
[0079] 取对数生长期的细胞，根据细胞的大小接种2~10 X103个于96孔板上，待生长24h 后，弃上清，然后按以下分组给药:癌细胞设不加药组和加药组（浓度0.0625~5μΜ对癌细 胞，浓度0.5~100μΜ对L02细胞），顺铂(Cisplatin)为阳性药物参照，藤黄酸和新藤黄酸作 母体化合物对照比较，对实施例1、2和4制备的相应偶联产物GA-P62-FA、GA-P282-FA和NGA-P62-FA进行细胞毒性检测。每组设4~6个复孔，培养72h后，弃上清，加入100μΙ含0.5mg/ml 的MTT(四氮唑盐)无血清培养液培养4h，加入100μ1 DMS0(二甲亚砜），放置于微型振荡仪上 振荡10min，再置于酶标仪上570nm处检测0D值。正常人细胞系L02做对照。每次实验均重复3 次。
[0080] 结果显示，随着药物浓度增加，与相应不加药对照组比较，细胞增殖活性分别下 降，说明化合物呈浓度依赖性抑制癌细胞的生长增殖。而对正常肝细胞系L02细胞的增殖活 性未有明显变化，显示出该化合物对正常细胞具有低毒特性(表1)。
[0081 ] 表1不同细胞的IC5Q值(7 2h)及不同化合物IC5Q比值
[0082]
[0083] 头 jMiyijy
[0084] 肿瘤靶向性藤黄酸类化合物的LD5Q试验
[0085]取18-22g的健康小鼠60只，10只/组，雌雄各半，实验前禁食12h，自由饮水。按等摩 尔量的藤黄酸对不同偶联组药物进行小鼠腹腔注射给药，按〇.2ml/10g体重给药，溶解溶媒 为阴性参照进行等体积给药，藤黄酸钠盐组为原药对照，观察各组小鼠出现的反应症状、死 亡时间并记录死亡数目数，首24h内多次观察，后续每天观察3次，连续观察12天，计算LD 50的 大概数值。实验结果表明，叶酸偶联的藤黄酸大大降低了原型药物的毒性，与藤黄酸钠盐比 较(小鼠静脉注射的LD 5Q = 38.8mg/kg)，部分叶酸修饰的癌细胞靶向性藤黄酸类化合物的 LD5〇 显著增加（G-P62-FA，G-P106-FA，G-P150-FA 和 G-P238-FA 的小鼠静脉注射 LD5〇 分别为 75.12、74.6、81.21和92.411^/1^，以藤黄酸值换算）。
[0086]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种肿瘤靶向性藤黄酸类化合物，其特征在于:该化合物具有如式(I)所示的结构： G-P-FA (I) 其中，G为藤黄酸类化合物； P为HOCH2 (CH2OCH2) nCH2OH 或HOCH2 (CH2OCH2) nCH2NH2，其中 η为 0或 1 ~10之间的自然数； FA为叶酸或叶酸类似物； 所述FA以酯键或酰胺键与Ρ偶联，Ρ以端羟基与G的羧基偶联。2. 根据权利要求1所述的一种肿瘤靶向性藤黄酸类化合物，其特征在于:所述藤黄酸类 化合物为藤黄酸、新藤黄酸、别藤黄酸、藤黄新酸或它们的混合物。3. 根据权利要求1所述的一种肿瘤靶向性藤黄酸类化合物，其特征在于:所述Ρ的平均 分子量为61~600。4. 根据权利要求1所述的一种肿瘤靶向性藤黄酸类化合物，其特征在于:所述Ρ的分子 量61、62、105、106、149、150、237、238、281、282、325、326、413、414、501或502。5. 根据权利要求1所述的一种肿瘤靶向性藤黄酸类化合物，其特征在于:所述叶酸类似 物为5-甲基四氢叶酸、5-甲酰基四氢叶酸、甲氨蝶呤或5,10-亚甲基四氢叶酸。6. 根据权利要求1所述的一种肿瘤靶向性藤黄酸类化合物的制备方法，其特征在于包 括以下操作步骤： (1) 取叶酸溶于a溶剂中，在脱水剂Ν，Ν'_二环己基碳二亚胺或1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，以及催化剂对二甲氨基吡啶作用下，〇°C搅拌反应1~6h;然后与叶酸 等摩尔比加入低聚化乙二醇，从冰浴中升高温度至室温，避光搅拌过夜;过滤除副产物，滤 液浓缩，冰乙醚沉淀重结晶或制备液相纯化，冻干即得叶酸偶联低聚化乙二醇； 或者，取叶酸的活性酯或叶酸类似物的活性酯溶解于无水DMSO/TEA中，加入与叶酸的 活性酯等摩尔的低聚化乙二醇一端氨基化的衍生物，无水条件下反应过夜，真空冻干分离 或色谱纯化，即得叶酸偶联低聚化乙二醇氨基化衍生物； 所述低聚化乙二醇为HOCH2(CH2OCH2)nCH 2OH，所述低聚化乙二醇一端氨基化的衍生物为 HOCH2 (CH2OCH2) nCH2NH2)，其中η为0或1~10之间的自然数； (2) 将藤黄酸类化合物溶于a溶剂中，在脱水剂Ν，Ν'_二环己基碳二亚胺或1-(3-二甲氨 基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，以及催化剂对二甲氨基吡啶作用下，0°C搅拌反应1~6h; 然后按藤黄酸类化合物摩尔比1:1-3的量加入步骤（1)所得叶酸偶联低聚化乙二醇或叶酸 偶联低聚化乙二醇氨基化衍生物，从冰浴中升高温度至室温，避光搅拌过夜;过滤液浓缩， 冰乙醚或异丙醇重结晶，层析或制备液相纯化，冻干即可获得结构如式(I)所示的肿瘤靶向 性藤黄酸类化合物。7. 根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于:步骤（1)所述a溶剂为CH2C12、DMS0或 DMF;所述搅拌反应的时间为2.5h;所述室温为25°C ;所述无水DMSO/TEA中DMSO和TEA的体积 比为2:1; 步骤（2)所述a溶剂为CH2C12、DMS0或DMF;所述搅拌反应的时间为2.5h;所述室温为25 Γ。8. 根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于:步骤(1)所述叶酸、脱水剂和催化剂的 摩尔比为1:1:1~1:30:30;步骤(2)所述藤黄酸类化合物、脱水剂、催化剂的摩尔比为1:1:1 ~1:25:25〇9. 根据权利要求1所述的一种肿瘤靶向性藤黄酸类化合物或其药学上可接受的盐在制 备治疗癌症疾病的药物中的用途。10. 根据权利要求9所述的用途，其特征在于:所述药物中含有治疗有效量的肿瘤靶向 性藤黄酸类化合物或其药学上可接受的盐及药学上可接受的载体。
【文档编号】A61P35/00GK106083898SQ201610378426
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年5月31日
【发明人】彭咏波, 刘腾, 李雄
【申请人】彭咏波