睡茄交酯类化合物及提取方法及用图
【专利摘要】本发明公开了睡茄交酯类化合物及提取方法及用途，睡茄交酯类化合物，具有式(I)的结构：本发明的睡茄交酯类化合物能有效地抑制一氧化氮(NO)的释放，提示本发明化合物可作为抗炎的药物。
【专利说明】
睡茄交酯类化合物及提取方法及用途
技术领域
[0001]本发明涉及中药提取领域，涉及一种睡茄交酯类化合物、提取方法及用途。
【背景技术】
[0002]苦藤(Physalis angulata L.)，又称灯笼草、天泡子、天泡草、朴朴草、打额泡等， 为前科(Solanaceae)酸衆属(Physalis)-年生草本植物。《陆川本草》和《中华本草》对苦藤 的药用功效有着详细的记载，苦藤具有行气，消胀，利尿，治腹胀，清热解毒，利尿止血，消肿 散结，可用于治疗咽喉肿痛，肺痈，腮腺炎;小便不利，血尿牙龈肿痛，天疱疮等疾病。民间多 用于治疗疱疮、牙龈肿痛、湿热黄疸、咽喉红肿疼痛、肺热咳嗽等疾病。国内外学者通过体 内、体外实验证实了苦藤的抗炎（Choi, E.M.;et al.Investigations of antiinflammatory and antinociceptive activities of Piper cubeba,Physalis angulata and Rosa hybrida. Journal of Ethnopharmacology 2003,89,171-175.)、抗肿瘤（He,H·; et al.Physalin A induces apoptotic cell death and protective autophagy in HT1080human fibrosarcoma cells.Journal of Natural Products,2013,76,880-888.)n 抗菌（Si lva，M · T · G · ; et al. Studies on antimicrobial activity , in vitro , of Physalis angulata L.(Solanaceae)fraction and physalin B bringing out the importance of assay determination.Memorias do Instituto Oswaldo Cruz 2005, 100,779-782·)、抗氧化（Choi,E.M.;et al.Effect of some medicinal plants on plasma antioxidant system and lipid levels in rats.Phytotherapy research · 2005，19，382-386 ·)等作用。
[0003] 但从苦藤中提取睡茄交酯类化合物、提取方法及用途尚未见报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供睡茄交酯类化合物。
[0005] 本发明的第二个目的是提供睡茄交酯类化合物的提取方法。
[0006] 本发明的第三个目的是提供睡茄交酯类化合物的用途。
[0007] 本发明的第四个目的是提供包含睡茄交酯类化合物的苦藤提取物。
[0008] 本发明的第五个目的是提供苦藤提取物的用途。
[0009] 本发明的第六个目的是提供含睡茄交酯类化合物的药物组合物。
[0010] 本发明的第七个目的是提供上述药物组合物的用途。
[0011] 本发明的技术方案概述如下：
[0012] 睡茄交酯类化合物，具有式(I)的结构：
[0013]
[0014] 其中：
[0015] 办为0!1，(：1 或 0CH3;
[0016] R2 为 OH; R3 为 OH，0CH3 或 OAc;或 R2 和尺3为 ^ 〇
[0017] 上述化合物，优选的结构式为：
[0018]
[0019] 上述化合物的提取方法，包括如下步骤：
[0020] (1)以苦藤的干燥茎叶为原料，加入原料8-10质量倍的体积分数为60 %-80%乙醇 水溶液，回流提取2-3次，每次提取2-3小时，合并得到提取液，减压回收溶剂，浓缩后得到总 浸膏；
[0021] (2)将总浸膏分散到5-10质量倍的水中，依次用石油醚和乙酸乙酯进行萃取，乙酸 乙酯萃取液减压回收溶剂，得到乙酸乙酯层浸膏；
[0022] (3)乙酸乙酯层浸膏经硅胶柱色谱分离，以体积比分别为100:1、50:1、30:1和15:1 的二氯甲烷一甲醇为洗脱剂梯度洗脱，得到馏分Fr. 1、Fr. 2、Fr. 3和Fr. 4;
[0023] (4)馏分Fr. 4经硅胶柱色谱分离，以体积比为80 :1、40 :1、20 :1、10 :1和5 :1的氯 仿一丙酮为洗脱剂等度洗脱，得到馏分Fr. 4-1、Fr. 4-2、Fr. 4-3、Fr. 4-4和Fr. 4-5;
[0024] (5)馏分Fr. 4-2经制备HPLC色谱，以体积比为7: 3的甲醇-水为流动相，进行纯化， 得到化合物7;
[0025] (6)馏分Fr .4-5经0DS柱色谱分离，以体积比为1: 9、3: 7、5:5和8: 2的甲醇-水为洗 脱剂梯度洗脱，得到馏分 Fr · 4-5-1、Fr · 4-5-2、Fr · 4-5-3 和 Fr · 4-5-4;
[0026] (7)馏分Fr. 4-5-2经制备HPLC色谱，以体积比为7 : 3的甲醇-水为流动相，进行纯 化，得到化合物1，化合物4，化合物5和化合物6;
[0027] (8)馏分Fr. 4-5-3经制备HPLC色谱，以体积比为7 : 3的甲醇-水为流动相，进行纯 化，得到化合物2;
[0028] (9)馏分Fr. 4-5-4经制备HPLC色谱，以体积比为7 : 3的甲醇-水为流动相，进行纯 化，得到化合物3。
[0029] 睡茄交酯类化合物在制备抑制细胞释放N0药物中的用途。
[0030] 包含睡茄交酯类化合物的苦藤提取物。
[0031] 苦藤提取物在制备抑制细胞释放N0药物中的用途。
[0032] -种药物组合物，是包含睡茄交酯类化合物或其药学上可接受的盐，和药学上可 接受的载体和/或赋形剂。
[0033]上述药物组合物在制备抑制细胞释放N0药物中的用途。
[0034]本发明的优点：
[0035]本发明的睡茄交酯类化合物能有效地抑制一氧化氮(N0)的释放，提示本发明化合 物可作为抗炎的药物。
【具体实施方式】
[0036]下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行描述，所描述的实施例仅仅是本 发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在 没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0037] 实施例1
[0038]睡茄交酯类化合物的提取方法，包括如下步骤：
[0039] (1)以苦藤(Physalis angulata L.)的干燥莖叶（9.5kg)为原料，加入原料9质量 倍的体积分数为75%乙醇水溶液，回流提取2次，每次提取2小时，合并得到提取液，减压回 收溶剂，浓缩后得到总浸膏（1370g);
[0040] (2)将总浸膏分散到5质量倍的水中，依次用等体积石油醚和乙酸乙酯进行萃取， 乙酸乙酯萃取液减压回收溶剂，得到乙酸乙酯层浸膏116g;
[0041] (3)乙酸乙酯层浸膏经硅胶柱色谱分离，以体积比分别为100:1、50:1、30:1和15:1 的二氯甲烷一甲醇为洗脱剂梯度洗脱，得到馏分?^1及.2及.3和?^4(15 8);
[0042] (4)馏分Fr. 4经硅胶柱色谱分离，以体积比为80 :1、40 :1、20 :1、10 :1和5 :1的氯 仿一丙酮为洗脱剂等度洗脱，得到馏分Fr. 4-1、Fr. 4-2( 2g)、Fr. 4-3、Fr. 4-4和Fr. 4-5;
[0043] (5)馏分Fr. 4-2经制备HPLC色谱，以体积比为7: 3的甲醇-水为流动相，进行纯化， 得到化合物7(22mg);
[0044] (6)馏分Fr. 4-5经0DS柱色谱分离，以体积比为1:9、3: 7、5:5和8: 2的甲醇-水为洗 脱剂梯度洗脱，得到馏分Fr · 4-5-1、Fr · 4-5-2 (800mg)、Fr · 4-5-3 (200mg)和Fr · 4-5-4 (150mg)；
[0045] (7)馏分Fr. 4-5-2经制备HPLC色谱，以体积比为7 : 3的甲醇-水为流动相，进行纯 化，得到化合物l(l〇mg)，化合物4(10mg)，化合物5(4mg)和化合物6(21mg);
[0046] (8)馏分Fr. 4-5-3经制备HPLC色谱，以体积比为7 : 3的甲醇-水为流动相，进行纯 化，得到化合物(31mg);
[0047] (9)馏分Fr. 4-5-4经制备HPLC色谱，以体积比为7 : 3的甲醇-水为流动相，进行纯 化，得到化合物3(10mg)。
[0048] 各化合物的物理化学和常数如下：
[0049] 化合物 1:无定型粉末；[?]? + 124.0(c 0.05，Me0H);UV(Me0H)Xmax(l〇ge)212(4.2) nm；IR(KBr)vmax 3398,2921,2851,676,1648,1467,1384ai33cm_1；CD(MeOH)nm(Δ ε)252( + 3.9)，331(-1.7);HRESnffi m/z 509.2516[M+Na] + (calcd for C28H38〇7Na，509.2515)，确定 化合物 1 的分子式为 C28H38〇7;1H(400MHz，pyridine-d5WP13C-NMR(100MHz，pyridine-d5#^ 据见表1和3。
[0050] 化合物2:无定型粉末；[?]:Γ +82,6(c 0.055，Me0H);UV(Me0H)Amax(l〇ge)214(4.3) nm；IR(KBr)vmax 3427,2921,2851,1676,1467,1384,1132αιι_1 ；CD(MeOH)nm( Δ ε)252(+4.7), 330(-2.3) ;HRES頂Ε m/z 509.2515[M+Na] + (calcd for C28H38〇7Na，509.2515)，确定化合物 2的分子式为C28H3807 ; hHOOMHz，pyridine-d5; 600MHz，DMS〇-d6)和 13C-NMR( 100MHz， pyridine_d5; 150MHz，DMS0_d6)数据见表 1 和5。
[0051 ]化合物3:无定型粉末；[a￡5 +40,0(c 0.05，Me0H);UV(Me0H)Amax(l0ge)216(3.9) nm;IR(KBr)vmax 3395，2921，2849，1646，1469，1384，1119cm-1;CD(Me0H)nm(Δ ε)252(+1·7)， 331(-1.1);HRES頂E m/z 535.2667[M+Na] + (calcd for C3〇H4()〇7Na，535.2672)，确定化合物 3 的分子式为 〇3。114。〇7;111(4001!^474(^116-(15)和13(：-匪1?(1001抱474乜116-(15)数据表1和 3〇
[0052] 化合物4:无定型粉末；[?]?_+. 65.5(c 0.055，Me0H);UV(Me0H)Amax(l〇ge)218(3.8) nm;IR(KBr)vmax 3395,2920,2849,1647,1469,1384,1130cm-1 ;HRESME m/z 551.2614[M+ Na] + (calcd for C3QH4Q〇8Na，551 · 2621)，确定化合物4的分子式为C3qH4q〇8 ; ^(400MHz，DSM0-d6)和130匪1?(1001抱，05]\?)-(16)数据见表1和3。
[0053] 化合物5:无定型粉末；[α],? + 160.0(c 0.05，Me0H);UV(Me0H)Amax(l〇ge)216(4.2) nm；IR(KBr)vmax 3397,2921,2850,1677,1646,1467,1384,1133cm_1；CD(Me0H)nm(Δ ε)252( + 4.4)，330(-1.7);HRESnffi m/z 523.2670[M+Na] + (calcd for 〇29114。〇7似，523.2672)，确定 化合物 5 的分子式为 029^()07^11(4001?，pyridine-d5 ;600MHz，DMS0-d6)和 13C-NMR(100MHz， pyridine_d5; 150MHz，DMS0_d6)数据见表2 和4。
[0054] 化合物6:无定型粉末；[a]f +66.7(c 0.045，Me0H);UV(Me0H)Amax(l〇ge)218(4.1) nm；IR(KBr)vmax 3399,2920,2850,1681,1646,1467,1384,1129cm_1；CD(Me0H)nm(Δ ε)250( + 4.3)，332(-1.2);HRESnffi m/z 523.2672[M+Na] + (calcd for 〇29114。〇7似，523.2672)，确定 化合物 6 的分子式为 029^()07^11(4001?，pyridine-d5 ;600MHz，DMS0-d6)和 13C-NMR(100MHz， pyridine_d5; 150MHz，DMS0_d6)数据见表2 和4。
[0055] 化合物7:无定型粉末；[?f + I63.6(c 0.055，Me0H) ;UV(Me0HUmax(l0ge)216 (4.2)nm;IR(KBr)vmax 3395，1732，1711，1686，1647cm-1;CD(Me0H)nm(Ae)252(+2.9)，330(-2.1);HRESIME m/z 565.2783[M+Na] + (calcd for C3iH42〇8Na，565.2777)，确定化合物7的分 子式为 CsiiteOs^HHOOMHzAyridine-ds)和 130匪以1001抱474(1丨116-(15)数据见表2和4〇
[0056] 表1化合物1-4的氢谱数据
[0057]
[0058]
[0059] 注：a，400MHz，pyr i d ine-d5; b，600MHz，DMS〇-d6; c，400MHz，DMS〇-d6。
[0060] 表2化合物5-7的氢谱数据
[0061]
[0064] 注：a，400MHz，pyridine_d5; b，600MHz，DMS0_d6。
[0065] 表3化合物1-4的碳谱数据
[0066]
[0068] 注：a，400MHz，pyr id ine-d5; b，600MHz，DMS〇-d6; c，400MHz，DMS〇-d6。
[0069] 表4化合物5-7的碳谱数据
[0070]
[0072] 注：a，400MHz，pyr i d ine-d5; b，600MHz，DMS〇-d6。
[0073] 各化合物的结构为：
[0074]
[0075] 实施例2
[0076] 睡茄交酯类化合物的提取方法，包括如下步骤：
[0077] (1)以苦藤的干燥茎叶为原料，加入原料8质量倍的体积分数为80 %乙醇水溶液， 回流提取3次，每次提取2小时，合并得到提取液，减压回收溶剂，浓缩后得到总浸膏；
[0078] (2)将总浸膏分散到5质量倍的水中，依次用等体积石油醚和乙酸乙酯进行萃取， 乙酸乙酯萃取液减压回收溶剂，得到乙酸乙酯层浸膏；
[0079] (3)-(9)同实施例1(3)_(9)。
[0080] 实施例3
[0081] 睡茄交酯类化合物的提取方法，包括如下步骤：
[0082] (1)以苦藤的干燥茎叶为原料，加入原料10质量倍的体积分数为60 %乙醇水溶液， 回流提取3次，每次提取2小时，合并得到提取液，减压回收溶剂，浓缩后得到总浸膏；
[0083] (2)将总浸膏分散到10质量倍的水中，依次用等体积石油醚和乙酸乙酯进行萃取， 乙酸乙酯萃取液减压回收溶剂，得到乙酸乙酯层浸膏；
[0084] (3)-(9)同实施例1(3)_(9)。
[0085] 实施例4
[0086] 睡茄交酯类化合物抑制小鼠巨噬细胞RAW 264.7释放一氧化氮(N0)的活性测试小 鼠巨噬细胞RAW 264.7(ATCC)培养于10%热灭活（56°C，30min)胎牛血清（Gibco，USA)、 1001]/11^青霉素钠(6讣(3〇，1]5厶）、10(^8/11^链霉素(6讣(3〇，1]5厶）的1^]\0 1640(611^〇，1]5厶)培 养液中，37°C，5 %0)2的恒温培养箱中孵育生长。由于N0极不稳定，在细胞培养上清液内很 快代谢成亚硝酸基(MV)，故采用Griess法测定样品中Ν0：Γ的浓度作为衡量N0水平的指标。 Griess试剂A:0· 1 %N_萘乙二胺盐酸盐(naphthylethylene diamine dihydrochloride)溶 于水中；Griess试剂B: 1 %对氨基苯磺酰胺(sulphanilamide)溶于5%H3P〇4中。使用前等体 积混合试剂纟和8。用1?^1 1640培养液将1^1 264.7细胞稀释至5\105〇6118/1^浓度，接种 于96孔细胞培养板中，每孔加入200100yL细胞悬浮液。C0 2培养箱中培养lh后，每孔加入脂 多糖（lipopolysaccharide，LPS)(Sigma，JPN)(终浓度lyg/mL)和DMSO溶解的不同浓度的测 试样品0.4yL，同时设LPS组(加入LPS，但不加入测试样品，对NO释放的抑制率为0% )和空白 对照组(不加入LPS和测试样品，仅加入0.4yL DMS0，对NO释放的抑制率为100 % )，每个样品 设4个平行孔。在37°C，5%C02的恒温培养箱中培养24h，吸取100yL培养液上清至酶标板中， 离心（1000 Xg，4°C，3min)，加入100yL Griess试剂，室温避光反应lOmin，于酶标仪测定其 540nm处吸光值。用浓度分别为1、5、10、50ymol/L的NaN0 2绘制标准曲线，根据NaN02标准曲线 细胞培养上清液中NOf的浓度进而计算测试样品对NO释放的抑制率。
[0087]表5化合物的抑制N0释放结果
[0088]
[0089] 含有本发明所述化合物的组合物的抗炎药物可以为适用于口服或注射等应用形 式，例如，按常规技术，加入药物可接受的载体和/或赋形剂制成片剂、胶囊剂、粉剂、糖浆 剂、针剂等。
[0090] 化合物具有药理活性，因此，含有该化合物的组合物也具有药理活性。
[0091] 以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其中心思想。应当指出，对 于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干 改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护。
[0092] 本发明的睡茄交酯类化合物、含睡茄交酯类化合物的提取物、含睡茄交酯类化合 物的组合物能制备治疗一氧化氮代谢异常相关联疾病的药物。
[0093] 其相关联的疾病包括:全身炎症反应综合症、高血压、脑血栓、心力衰竭、肝硬化、 类风湿性关节炎、骨关节炎、脊柱关节炎、炎性肠病、急性胰腺炎、腹膜炎、胆囊炎、阑尾炎、 糖尿病、系统性红斑狼疮、皮炎肌、银肩病、急性髓性白血病、帕金森症、早老性痴呆、抑郁 症、败血症、慢性阻塞性肺炎、哮喘、急性胰腺炎、中枢神经损伤等。其次，N0代谢异常还与癌 变及癌组织的增生有关，高浓度的N0也会诱发基因突变和肿瘤，上述化合物可以抑制N0释 放，从而发挥抗肿瘤的作用。适用的肿瘤例子包括但不限于:各种实体肿瘤和白血病，如肺 癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、骨癌、食道癌、前列腺癌、结肠癌、卵巢癌、膀胱癌、子宫颈癌、黑色素 瘤、睾丸癌、支气管癌、肾细胞癌、胆管癌、绒毛膜癌、胶质细胞瘤、神经纤维瘤、纤维肉瘤、淋 巴管瘤等。
【主权项】
1. 睡茄交酯类化合物，其特征是具有式(I)的结构： 其中：Ri 为OH，Cl或OCH3; R2 为 OH; R3 为 OH，OCH3 或 OAc;或 R2 和 R32. 如权利要求1所述的化合物，其特征在于所述化合物结构式为：3. 权利要求1或2所述化合物的提取方法，其特征在于包括如下步骤： (1) 以苦藤的干燥茎叶为原料，加入原料8-10质量倍的体积分数为60% -80 %乙醇水溶 液，回流提取2-3次，每次提取2-3小时，合并得到提取液，减压回收溶剂，浓缩后得到总浸 膏； (2) 将总浸膏分散到5-10质量倍的水中，依次用石油醚和乙酸乙酯进行萃取，乙酸乙酯 萃取液减压回收溶剂，得到乙酸乙酯层浸膏； (3) 乙酸乙酯层浸膏经硅胶柱色谱分离，以体积比分别为100:1、50:1、30:1和15:1的二 氯甲烷一甲醇为洗脱剂梯度洗脱，得到馏分Fr. I、Fr. 2、Fr. 3和Fr. 4; (4) 馏分Fr. 4经硅胶柱色谱分离，以体积比为80:1、40:1、20:1、10:1和5:1的氯仿一丙 酮为洗脱剂等度洗脱，得到馏分Fr. 4-1、Fr. 4-2、Fr. 4-3、Fr. 4-4和Fr. 4-5; (5) 馏分Fr. 4-2经制备HPLC色谱，以体积比为7: 3的甲醇-水为流动相，进行纯化，得到 化合物7; (6) 馏分Fr. 4-5经ODS柱色谱分离，以体积比为1:9、3:7、5: 5和8: 2的甲醇-水为洗脱剂 梯度洗脱，得到馏分 Fr · 4-5-1、Fr · 4-5-2、Fr · 4-5-3 和 Fr · 4-5-4; (7) 馏分Fr. 4-5-2经制备HPLC色谱，以体积比为7 : 3的甲醇-水为流动相，进行纯化，得 到化合物1，化合物4，化合物5和化合物6; (8) 馏分Fr. 4-5-3经制备HPLC色谱，以体积比为7 : 3的甲醇-水为流动相，进行纯化，得 到化合物2; (9) 馏分Fr. 4-5-4经制备HPLC色谱，以体积比为7 : 3的甲醇-水为流动相，进行纯化，得 到化合物3。4. 权利要求1或2的睡茄交酯类化合物在制备抑制细胞释放NO药物中的用途。5. 包含睡茄交酯类化合物的苦藤提取物。6. 权利要求5的苦藤提取物在制备抑制细胞释放NO药物中的用途。7. -种药物组合物，其特征是包含睡茄交酯类化合物或其药学上可接受的盐，和药学 上可接受的载体和/或赋形剂。8. 权利要求7的药物组合物在制备抑制细胞释放NO药物中的用途。
【文档编号】A61P25/24GK106008641SQ201610339139
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月20日
【发明人】邱峰, 孙成鹏, 陈丽霞, 赵烽, 康宁, 丁丽琴
【申请人】天津中医药大学