槲皮素糖苷类化合物在治疗肝纤维化中的用图
【专利摘要】本发明涉及医药领域，具体涉及槲皮素糖苷类化合物在治疗肝纤维化中的用途。药效学试验证明，槲皮素糖苷类化合物具有逆转CCl4能引起的肝损伤、肝实质细胞坏死、肝纤维化的作用，具有一定的保肝活性。槲皮素糖苷类化合物还能抑制炎症状态下HSC细胞的增殖和活化，从而发挥抗肝纤维化的作用。
【专利说明】
槲皮素糖苷类化合物在治疗肝纤维化中的用途
技术领域
[0001] 本发明涉及医药领域，具体涉及槲皮素糖苷类化合物在治疗肝纤维化中的用途。
【背景技术】
[0002] 肝纤维化是由肝损伤引起的持续性炎症反应，肝脏中细胞外基质的数量及构成发 生改变，正常的降解过程受到抑制，堆积增加，导致过多的不溶性基质堆积在肝脏中，引起 正常组织结构破坏直至器官衰竭，最终发展为肝硬化甚至肝癌。肝硬化是肝脏实质性病变， 医学界普遍认为较难逆转，而肝纤维化则是可逆转的，因此逆转肝纤维化的研究已成为学 界关注的一个热点课题。
[0003] 大量研究表明，肝脏内慢性的炎症反应是导致肝纤维化的主要诱因。巨噬细胞是 肝脏炎症反应的主要效应细胞，其中Kupffer细胞是肝脏中最主要的驻留型巨噬细胞。在 肝损伤过程中，Kupffer细胞除直接参与炎症反应外，还能分泌多种促纤维化细胞因子（如 TNF-a，IL-l，IL-6，TGF-0，PDGF)，刺激肝星状细胞（h印atic stellate cells，HSC)的增 殖、迀移和活化，促进细胞外基质产生和纤维化形成。其中，TGF-β被认为是最有效的刺激 HSC细胞活化的因子之一。此外，Kupffer细胞还释放大量的氧自由基（reactive oxygen species，ROS)，持续的氧化应激也能诱导激活HSCs，维持肝纤维化的进程。
[0004] 目前，临床上常用的治疗肝纤维化的药物主要有干扰素、秋水仙碱等，但治疗效果 有限，且副作用大。因此，市场上仍需要有效的抗肝纤维化药物的开发。
[0005] 槲皮素属于黄酮类化合物，广泛存在于多种药用植物和蔬菜水果中。研究表明，槲 皮素及其糖苷类衍生物具有抗炎、抗氧化、降压、抗抑郁等广泛的药理学作用，但至今未见 此类化合物在制备抗肝纤维化治疗药物中的应用报道。
[0006] 槲皮素及其糖苷的结构如下：
【发明内容】
[0008] 本发明公开了槲皮素糖苷治疗肝纤维化的用途。本发明所述槲皮素糖苷优选下列 结构通式：
[0009]
[0010] 其中 R 代表-C00H 或-CH2X，其中 X 代表 0H、F、Cl、Br、I、CN、N02、NH2、CF3、SH、0CH3、 0C 2H5 或 C00H〇
[0011] R优选代表_CH20H，即异槲皮苷（代号IQ)。
[0012] R还优选代表-C00H，即槲皮素-3-0- β -D-葡萄糖醛酸苷（代号QB)。
[0013] R还优选代表_CH20CH3。即槲皮素-3-0-β -D-葡萄糖醛酸甲酯（代号QC)
[0014] R还优选代表_CH2F。即氟代异槲皮素苷（代号QF)。
[0015] 下面是槲皮素糖苷的部分药效学试验及结果：
[0016] -、槲皮素糖苷类化合物对CC14引起的大鼠肝纤维化模型体内作用研究
[0017] 雄性SD大鼠56只，体重180-200g/只，分笼饲养，自由饮水，室温20-25°C，光照 12小时/天。随机抽签分为7组，每组8只：①正常组（ND);②模型组（M0);③异槲皮苷 组（IQ，25mg/kg/d);④槲皮素-3-0-β-?-葡萄糖醛酸苷组（QB，25mg/kg/d);⑤槲皮素组 (Q，50mg/kg/d);⑥槲皮素-3-0-β-?-葡萄糖醛酸甲酯：(QC，25mg/kg/d);⑦氟代异槲皮素 苷：（QF，25mg/kg/d)。正常组给予橄榄油溶液3mL/kg皮下注射，每周2次，共8周；其余组 别首剂按5ml/kg给予40% CC14橄榄油溶液皮下注射，以后按3ml/kg给予，每周2次，共8 周。每天上午相同时间点分别灌胃给予相应药物，每周按体重调整给药剂量，给药4周。给 药结束后，禁食16小时，股动脉采血，脱颈椎处死，取肝脏并按常规制备血清、肝组织匀浆。 检测血清中谷丙转氨酶（ALT)和谷草转氨酶（AST)水平。检测肝脏组织中活性氧（reactive oxygen species, R0S)和 SOD 水平，以及 kupffer 细胞和 HSC 数目。
[0018] (1)槲皮素糖苷类化合物对血清ALT和AST水平的影响
[0019] 表1.槲皮素糖苷类化合物对血清ALT和AST水平的影响
[0020]
[0021] 相较于正常组，aP〈0. 5 ;相较于模型组，bP〈0. 5。
[0022] 结果显示：与正常组相比，模型组血清ALT和AST水平显著升高；与模型组相比， 槲皮素糖苷类化合物QB、IQ、QC和QF均能显著下调血清中ALT和AST水平，而槲皮素（Q) 能显著下调AST水平，但对ALT没有明显影响。以上结果表明，CC14能引起明显的肝损伤， 导致肝实质细胞坏死，发生肝纤维化，而槲皮素糖苷类化合物则能逆转这一作用，具有一定 的保肝活性。
[0023] (2)槲皮素糖苷类化合物对肝脏组织中Kupffer细胞的影响
[0024] 结果见图1，图1显示：与正常组相比，模型组肝脏中Kupffer细胞数目明显增加， 其标志表达物CD68含量明显升高；与模型组相比，槲皮素糖苷类化合物QB、IQ和QC均能极 显著减少肝脏组织Kupffer细胞的数目，下调⑶68的表达，而QF和Q对肝脏组织中Kupffer 细胞的数目具有一定的下调作用，但作用不显著。这表明槲皮素糖苷类化合物QB、IQ和QC 可能通过调控Kupffer细胞，改善肝脏中的炎症状态，从而发挥抗肝纤维化作用。
[0025] (3)槲皮素糖苷类化合物对肝脏中HSC细胞的影响
[0026] 结果见图2,图2显示：与正常组相比，模型组肝脏组织中HSC细胞数量明显增加； 与模型组相比，槲皮素糖苷类化合物IQ，QB和QC均可明显减少HSC细胞的数目，并且如图 QB组的效果是最好的，而槲皮素对HSC细胞没有显著影响。此部分结果说明，在CC14诱导 的肝损伤过程中，槲皮素糖苷类化合物IQ，QB和QC都能够抑制HSC细胞的增殖。
[0027] (4)槲皮素糖苷类化合物对肝脏组织中氧化和抗氧化指标的影响
[0028] 结果见图3,图3显示：与正常组相比，模型组肝脏中氧化还原水平失衡，R0S产生 显著增多，而S0D酶活力明显下降；与模型组相比，槲皮素糖苷类化合物IQ，QB和QC均能 显著减少肝脏中R0S的含量，升高S0D活力，而Q则对肝脏中的氧化抗氧化水平没有显著影 响。此部分结果表明，槲皮素糖苷类化合物IQ，QB和QC能够减轻肝脏的氧化损伤，减少R0S 的产生，提高S0D活力，具有保肝作用。
[0029] 二、槲皮素糖苷类化合物对LPS诱导的Kupffer细胞与HSC细胞共培养模型的体 外作用研究（1)大鼠原代HSC细胞和Kupffer细胞的分离培养
[0030] 选用正常雄性SD大鼠，以10%水合氯醛（300 μ L/100g)麻醉后固定体位、消毒， 依次打开皮肤、腹腔暴露门静脉和下腔静脉，，打开胸腔下腔静脉胸段后插入静脉套管针 以动脉夹固定，剪开门静脉，同时排空套管针内的空气，向肝脏灌注37°C预热的HEPES缓冲 液，流速30mL/min。灌注15-20分钟后肝脏逐渐变为灰白色即刻停止灌注，换用37°C预热 的0. 02%含钙（0. 06% )胶原酶灌注，流速为15mL/min，待看到肝脏表面出现囊泡或者裂 痕时立即停止灌注，小心将肝脏取下放入盛有HEPES缓冲液的烧杯中轻轻冲洗一遍，然后 将肝脏转移至一个盛有无血清DMEM培养基的烧杯中，用无菌镊子撕破肝脏表面的纤维膜， 并不断抖动以抖落细胞。细胞悬液用200目滤网过滤，取过滤后的细胞悬液以50g离心90 秒，使肝脏中的HSC细胞、kupffer细胞与肝细胞分离出来。取上层清液，50g离心5分钟， 重复1-2次，弃沉淀。取上清液200g离心10分钟，取沉淀用含10% FBS的DMEM培养基重 悬后，再次200g离心10分钟，弃上清，余下的沉淀用含10% FBS的DMEM培养基重悬，调整 浓度为2X 105接种至培养瓶中，置于37°C，体积分数5%的C02培养箱中培养，每2-3天换 一次液。
[0031] 据上所述，50g离心90秒后分离肝细胞取得的上清液，4°C，450g离心10分钟，获 得肝脏非实质细胞。用Percoll两步梯度离心法1000g，4°C离心10分钟进行Kupffer细 胞的分离、纯化。用含10% FBS的DMEM培养基重悬，调整浓度为2X 105接种至6孔板中， 置于37°C，体积分数5% C02培养箱培养。2小时后，首次换液，洗去未贴壁的细胞，之后每 2-3天换一次液。
[0032] 采用台盼蓝染色法测定大鼠原代HSC细胞存活率为95 ± 2 %，Kupffer细胞存活率 为96 ± 2 %，结果表明，其细胞存活率满足体外培养的要求。
[0033] ⑵Kupffer细胞（正常）/HSC细胞共培养模型的建立
[0034] 取生长状态良好的Kupffer细胞，用0. 25%胰酶消化后，在組11。611(中间半透 膜的微孔直径为〇. 4 μ m)双层培养室的下室中加入lml密度为2 X 105的Kupffer细胞；此 时再将lmlHSC细胞以2X105个/ml的密度加入Millicell上层小室。用含10% FBS的 DMEM培养基，置于37 °C，体积分数5 %的C02培养箱内培养，每2天更换一次培养基。待5-7 天后，HSC细胞分化成熟，可以进行实验。
[0035] (3) Kupffer细胞（炎症状态）/HSC细胞共培养模型的建立
[0036] 取生长状态良好的Kupffer细胞，用0. 25%胰酶消化后，在Millicell (中间半透 膜的微孔直径为〇. 4 μ m)双层培养室的下室中加入lml密度为2 X 105的Kupffer细胞，加 入含10 % FBS及100ng/ml脂多糖的DMEM培养基培养24小时后，再将lmlHSC细胞以2 X 105 个/ml的密度加入Millicell上层小室。此时将所用的培养基均换为含10% FBS的DMEM 培养基，置于37°C，体积分数5%的C02培养箱内培养，每2天更换一次培养基。待5-7天 后，HSC细胞分化成熟，可以进行实验。
[0037] (4)实验分组及给药处理：
[0038] 正常组1 :HSC单独培养；
[0039] 正常组2 :Kupffer细胞与HSC细胞共培养（KC+HSC);
[0040] 模型组：LPS诱导的Kupffer细胞与HSC细胞共培养；
[0041] QC 组：50μΜ ;IQ 组：50μΜ ;QB 组：30μΜ ;Q 组：50μΜ ;
[0042] 采用上述两种共培养模型，置37 °C，体积分数5 % C02培养箱内培养24小时后，吸 弃下小室的培养基，下室加入含不同剂量药物的DMEM培养基lml，培养24小时或48小时 后，检测体系中HSC细胞数目、R0S水平及TGF- β含量。
[0043] 5.实验结果
[0044] (1)槲皮素糖苷类化合物对共培养模型中HSC细胞数目的影响
[0045] 结果见图4,图4显示：与正常组1相比，当正常的Kupffer细胞与HSC细胞共培养 24小时或48小时，体系中HSC细胞数目有所增加，但没有显著性差异；与正常组2相比，当 采用LPS诱导的炎症状态下的Kupffer细胞与HSC细胞共培养时，无论是24小时或是48小 时，体系中HSC细胞的数目均明显增加；而与模型组相比，槲皮素糖苷类化合物IQ和QB无 论作用24h或48h均能明显减少体系中HSC细胞的数量，而QC作用24h也能显著减少HSC 细胞的数量，但是药物Q对HSC细胞没有显著影响。此部分结果表明，槲皮素糖苷类化合物 IQ，QB和QC均能一定程度上抑制炎症状态下HSC细胞的增殖和活化，从而发挥抗肝纤维化 的作用。
[0046] (2)槲皮素糖苷类化合物对共培养模型中R0S水平的影响
[0047] 结果见图5,图5显示：与正常组1相比，当正常的Kupffer细胞与HSC细胞共培 养时，体系中R0S水平稍有上调，但没有显著性差异；与正常组2相比，当采用LPS诱导的炎 症状态下的Kupffer细胞与HSC细胞共培养时，体系中R0S水平显著上调；而与模型组相 比，槲皮素糖苷类化合物QC，IQ和QB均能显著下调R0S水平，其中以IQ和QB的效果最好 (P〈0. 001)，而药物Q对ROS水平没有显著影响。此部分结果表明，槲皮素糖苷类化合物QC， IQ和QB能极显著减少炎症状态下共培养体系中R0S的产生，维持体系氧化与抗氧化状态的 平衡。因此，槲皮素糖苷类化合物QC，IQ和QB也可能通过抑制体系中R0S的产生减少HSC 细胞的激活，从而发挥抗肝纤维化的作用。
[0048] (3)槲皮素糖苷类化合物对共培养模型中TGF-β含量的影响
[0049] 结果见图6,图6显示：与正常组1相比，当正常的Kupffer细胞与HSC细胞共培 养24小时或48小时时，体系中TGF-β的含量稍微有些上调，但没有显著性差异；与正常 组2相比，当采用LPS诱导的炎症状态下的Kupffer细胞与HSC细胞共培养时，无论是24 小时或是48小时，体系中TGF-β的含量都明显上调；而与模型组相比，槲皮素糖苷类化合 物QC，IQ和QB无论作用24h或48h均能明显下调体系中TGF-β的含量，其中QC和QB作 用48h更为显著（P〈0. 01)。此部分结果表明，槲皮素糖苷类化合物IQ，QB和QC均能通过 抑制TGF- β的释放，减少促纤维化因子的产生，抑制HSC细胞的激活，且QC和QB的效果更 好。但槲皮素 Q未见显著生物效应。
【附图说明】
[0050] 图1.是槲皮素糖苷类化合物对肝脏中Kupffer细胞的影响（注：白色箭头所示为 kupffer细胞标志物⑶68的表达）
[0051] 图2是槲皮素糖苷类化合物对肝脏中HSC细胞数目的影响（图中黑色箭头所示深 蓝色小点为HSC细胞）
[0052] 图3是槲皮素糖苷类化合物对肝脏组织中R0S和S0D含量的影响（相较于正常组， ###Ρ〈0· 001 ;相较于模型组，*Ρ〈0· 05, **Ρ〈0· 01，***Ρ〈0· 001)
[0053] 图4是槲皮素糖苷类化合物对共培养模型中HSC细胞数目的影响（相较于正常组 2，#Ρ〈0· 05, ##Ρ〈0· 01 ;相较于模型组，*Ρ〈0· 05, **Ρ〈0· 01)
[0054] 图5是槲皮素糖苷类化合物对共培养模型中R0S含量的影响（相较于正常组2， Ρ〈0· 01 ;相较于模型组，*Ρ〈0· 05, ***Ρ〈0· 001)
[0055] 图6是槲皮素糖苷类化合物对共培养模型中TGF- β含量的影响（相较于正常组 2, ##Ρ〈0· 01 ;相较于模型组，*Ρ〈0· 05, **Ρ〈0· 01)。
【主权项】
1. 搬皮素糖巧用于制备预防/治疗肝纤维化疾病的药物的用途。2. 权利要求1的用途，其中搬皮素糖巧具有下列结构通式（I):其中 R 代表-COOH 或-CHzX,其中 X 代表地、F、C1、Br、I、CN、N02、畑2、CFs、SH、OC册、 OC2H5 或 C00H。3. 权利要求2的用途，其中R代表-CH 20H。4. 权利要求2的用途，其中R代表-C00H。5. 权利要求2的用途，其中R代表-CH 2〇邸3。6. 权利要求2的用途，其中R代表-CH 2尸。
【文档编号】A61K31/7048GK106031732SQ201510109889
【公开日】2016年10月19日
【申请日】2015年3月12日
【发明人】尚靖, 高榕荫, 王路路, 王涛, 李妤, 丁琳, 张志超
【申请人】南京瑞菁医药科技有限责任公司