吡唑酞嗪化合物及其制备方法和用图
【专利摘要】本发明属药物合成领域，涉及式1的吡唑酞嗪化合物，尤其涉及一种含哌嗪的吡唑酞嗪化合物，及其制备方法和在医学上的应用。本发明的化合物通过体外Hedgehog信号通路中的靶基因Gli抑制活性测试，结果显示，所述的化合物具有良好的Hedgehog信号通路抑制活性，可进一步Hedgehog信号通路抑制剂和制备抗肿瘤药物。
【专利说明】
吡唑酞嗪化合物及其制备方法和用途
技术领域
[0001] 本发明属药物合成领域，涉及新型吡唑酞嗪化合物，制备方法和应用。具体涉及一 种含哌嗪的吡唑酞嗪化合物，及其制备方法和在医学上的应用。
【背景技术】
[0002] 据报道，恶性肿瘤已成为严重危害人民生命健康的常见病。据不完全统计，全世界 每年约有2000万的新发病例；我国每年的新发病例约为160-200万，死亡130万。研究显 示，由于肿瘤早期具有转移的能力，临床诊断的原发肿瘤中约50%的患者已产生远位转移， 肿瘤细胞増长快、易变异，从而产生多药耐药，导致化疗失败，据有关统计，其中90%以上与 肿瘤细胞的多药耐药相关，目前临床上应用的抗肿瘤药物远不能满足治疗的要求。
[0003] 分子靶向抗肿瘤药物的研究是当前抗肿瘤药物研究领域的主要潮流和趋势。近 年来，靶向Hedgeh 〇g(Hh)信号通路的抗肿瘤药物成为该领域新的研究热点。研究显示了 Hedgeh〇g(Hh)信号通路在肿瘤的发生发展中发挥着重要的作用，与人类约1/3的肿瘤有着 密切的联系。异常激活Hh信号传导，将导致髓母细胞瘤、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、结肠癌、 膀胱癌、卵巢癌等多种肿瘤的发生。Hedgehog是在研究果蝇的发育过程中发现的一种分节 性基因，Hh信号主要是通过跨膜蛋白Ptch和Smo介导向胞内传递。无Hh信号时，Ptch与 Smo结合，抑制Smo的作用，导致其下游转录因子G1 i转录活性的抑制。当有Hh信号时，Hh 与Ptch结合，解除Ptch对Smo的抑制作用，恢复活性的Smo通过级次信号转递，激活Gli 转录活性，启动Hh靶基因的转录和表达。
[0004] 目前在靶向Hh信号通路的抗肿瘤药物研究中，已有多个药物上市或进入临床研 究，如美国Genentech公司的Vismodegid (⑶C-0449)于2012年已被FDA批准上市，用于皮 肤癌的治疗。另外，Erismodegid(LDE225,瑞士 Norvatis 公司）、LEQ_506(瑞士 Norvatis 公司）和LY-2940680 (美国Lilly公司）等正在进行临床II期及III期，临床研究显示对 皮肤癌、脑癌、髓母细胞瘤和其他实体瘤疗效显著。
[0005] 更为有意义的是，有研究显示，Hedgehog信号通路抑制剂在治疗对酪氨酸激酶抑 制剂伊马替尼产生耐药的非小细胞肺癌（CML)患者过程中，不仅能减少CML细胞的数量， 还能减少耐伊马替尼CML细胞的生长，针对目前已有抗肿瘤药物耐药性的问题是肿瘤临床 治疗面临的重要难题，本申请的发明人拟提供具有我国自主知识产权的靶向Hh信号通路 的抗肿瘤药物，其对改善我国肿瘤患者的经济负担，提高肿瘤临床治疗效果，具有重要的意 义。
【发明内容】
：
[0006] 本发明的目的是提供具有良好Hedgehog信号通路抑制作用的新型吡唑酞嗪化合 物及其可药用盐，具体涉及一种含哌嗪的吡唑酞嗪化合物及其可药用盐。
[0007] 本发明的另一目的是提供上述含哌嗪的吡唑酞嗪化合物的制备方法。
[0008] 本发明的吡唑酞嗪化合物具有下述式1的结构：
[0009]
[0010] 本发明的化合物1的制备过程如下：
[0012] 本发明所述的化合物通过体外Hedgehog信号通路抑制活性测试，结果了所述的 化合物具有良好的Hedgehog信号通路抑制活性，可进一步研制开发用于诊断和治疗与 Hedgehog通路有关的病变，包括但不限于肿瘤形成、癌症、瘤形成和非恶性过度增殖性疾病 的药物。
[0013] 本发明对体外Hedgehog信号通路抑制活性测试结果显示，所述的化合物1显示出 较好的Hedgehog信号通路抑制活性，对于Hh信号通路中的靶基因Gli抑制活性IC 5。值小 于2nM ;所述的化合物可进一步制备Hedgehog信号通路抑制剂。
[0014] 本发明中，所采用的药效学试验方法，是本领域技术人员所熟知的方法；
[0015] 本发明中，所采用的NIH3T3细胞、双荧光素酶报告检测试剂盒、Ptch+/-P53-/_小 鼠和Brdu Cell Proliferation Kit试剂盒是本领域技术人员可通过市购的途径所获得 的。
[0016] 本发明的吡唑酞嗪化合物及其药用盐可制备治疗肿瘤的药物组合物，其中包含治 疗有效量的所述的化合物及其药用盐。
[0017] 本发明的吡唑酞嗪化合物尤其可制备Hedgehog信号通路抑制剂和抗恶性肿瘤药 物。鉴于异常激活Hh信号传导，将导致髓母细胞瘤、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、结肠癌、膀胱 癌、卵巢癌等多种肿瘤的发生，本发明所述的Hedgehog信号通路异常激活所致的相关肿瘤 包括，髓母细胞瘤、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、结肠癌、膀胱癌、卵巢癌、皮肤癌。
【附图说明】
[0018] 图1是本发明化合物对ptch+/-p53-/_小鼠髓母细胞瘤移植瘤模型体内抗肿瘤活 性结果。
【具体实施方式】：
[0019] 实施例1 :制备化合物1，2-(6-(4-(4-苄基酞嗪-1-基）-3_氮杂环丁醇-基）-吡 啶-3-基）_丙-2-醇
[0020] 1)合成6-哌嗪烟酸乙酯
[0021] 在乙腈（100ml)中加入 6-氯烟酸乙酯（12g, 0? 06mol)和哌嗪（8. 35g, 0? lOmol) 〇 加入碳酸钾（17. 87g, 0? 13mol)。氮气保护下，100°C回流，过夜反应。TLC(DCM:MeOH = 20:1) 监测反应完全，抽滤，滤除碳酸钾，蒸干滤液。加入乙酸乙酯、水分液，少量水洗两次，取有机 层。加入无水硫酸钠，静置。滤液旋干，即得产品11. 63g(乳白色固体），无须纯化直接用于 下一步反应。粗品产率：86. 6%。HPLC-MS(ESI+) : [M+H] + :236. 1.
[0022] 2)合成6-(4-(4-氯酞嗪-1-基）哌嗪-1-基）烟酸乙酯
[0023] 在 NMP (10ml)中加入 1，4-二氯酞嗪（1. 5g, 7. 6mmol, 1. 2equiv)、6_ 哌嗪烟酸乙酯 (1. 5g, 6. 4mol, 1. Oequiv)。碳酸钾（1. 8g, 12. 8mmol, 2. Oequiv)氮气保护下，80°C 下搅拌 12h。TLC(PE:EA= 1:1)监测反应完全，反应液倾至水（50ml)中，加入乙酸乙酯（50ml)，分 液，水层EA (50ml X 3)萃取，合并有机层，饱和氯化钠（50ml X 3)洗NMP，无水硫酸钠干燥， 减压蒸去溶剂，柱层析纯化（PE:EA = 2:1~1:1)，EA重结晶，得6-(4-(4_氯酞嗪-1-基） 哌嗪-1-基）烟酸乙酯1. 8g (淡黄色固体），产率：59. 5 %。4-匪1?(400MHz，DMS0-d6) 8 (ppm) :8. 84(d, J = 2. 3Hz, 1H), 8. 31 - 8. 22 (m, 1H), 8. 17 - 8. 03 (m, 2H), 8. 00 -7. 88 (m, 2H), 6. 69 (d, J = 9. 0Hz, 1H), 4. 34 (q, J = 7. 1Hz, 2H), 3. 96-3. 94 (m, 4H), 3. 66 = 3. 63 (m, 4H), L 37 (t, J = 7. 1Hz, 3H). HPLC-MS (ESI+) : [M+H]+: 398. 0, 400. 0.
[0024] 3)合成6-(4-(4-(1-甲基吡唑-6-基）酞嗪-1-基）哌嗪-1-基）烟酸乙酯
[0025] 在20ml微波管中依次加入化合物6-(4-(4-氯酞嗪-1-基）哌嗪-1-基）烟酸乙 酯（60〇11^，1.5臟〇1)、1-甲基-5-(4,4,5,5-四甲基-1，3,2-二氧硼烷-2-基）-111-吡唑 (628mg, 3. Ommol)、K3P04/3H20(804mg, 3. Ommol), KF(175mg, 3. Ommol)，二甲苯（10ml)，氣气 流吹3分钟，加入？(1肿113)2(]1 2(10511^，0.15_31)，氩气流吹3分钟，密闭。微波下〇3；[(^区6 microwave reacter, 12CTC，High absorption)福射 3h，TLC(PE:EA= 1:1)监测反应完全， 将反应液倾至水（50ml)中，加入乙酸乙酯（50ml)，分液，水层EA (20ml X 2)萃取，合并有 机层，饱和氯化钠（50ml X 3)洗涤，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂，得粗品500mg，柱层析纯化 (PE:EA = 1:1~1:2)洗脱，得6-(4-(4-(1_甲基吡唑-6-基）酞嗪-1-基）P辰嗪-1-基） 烟酸乙酯 400mg(白色固体）产率：60. 1%。HPLC-MS(ESI+) : [M+H] + :444. 3.
[0026] 4)合成2- (6- (4- (4- (1-甲基吡唑-6-基）酞嗪-1-基）哌嗪-1-基）-吡 啶-3-基）_丙-2-醇
[0027] THF(50ml)中加入6-(4-(4-(1_甲基吡唑-6-基）酞嗪-1-基）哌嗪-1-基） 烟酸乙酯（200mg，0. 45mmol)，恒压滴液漏斗装置密闭体系，氩气保护下转移碘甲烷格式 试剂（CH3MgI，1. 4mmol/ml，1M1)至恒压滴液漏斗，冰浴下滴入格氏试剂，滴加完后，常温 反应5h。TLC(EA)监测反应完全，加入饱和氯化铵溶液30ml，EA(20mlX2)萃取，旋干，得 粗品220mg，制备薄层层析纯化，EA展开3次，得2-(6-(4-(4-(1_甲基吡唑-6-基）酞 嗪-1-基）哌嗪-1-基）_吡啶-3-基）_丙-2-醇72mg(淡黄色固体）产率：16.6%。4 NMR(400MHz，CDCl3)S(ppm):8.35(d，J = 2. 4Hz，lH)，8.18 (d，J = 8.0Hz，1H)，8.07 (d，J =7. 7Hz, 1H), 7. 91-7. 83 (m, 2H), 7. 71 (dd, J = 8. 8, 2. 5Hz, 1H), 7. 65 (d, J = 1. 9Hz, 1H), 6. 75(d, J = 8. 8Hz, 1H), 6. 59 (d, J = 1. 9Hz, 1H), 4. 05 (s, 3H), 3. 83 (d, J = 6. 4, 4H)，3. 74 (d, J = 6. 3, 4H), 1. 58 (s, 6H) ? HPLC-MS (ESI+) : [M+H]+: 430. 2.。
[0028] 实施例2 :体外Hedgehog信号通路抑制活性测试试验
[0029] 转录因子Gli的双荧光素酶报告基因实验：NIH3T3细胞接种至48孔板，24h后以 lipo2000 转染试剂转染 Gli-firefly luciferase reporter 和 TK-Renilla luciferase r印orter载体至NIH3T3细胞。转染36h后，将鼠源重组的SHH及待测药物加至48孔板（每 组设3复孔；n = 3)。常规培养36h后，细胞用PBS洗1次，以双荧光素酶报告检测试剂盒 (Promega公司）测定Gli-luciferase活性，作为判断Hh通路活性指标；
[0030] 结果表明（如表1所不），本发明的化合物1显不出较好的Hedgehog信号通路抑 制活性，对于Hh信号通路中的靶基因Gli抑制活性IC 5。值小于2nM ;本发明的化合物可以 进一步研制开发Hedgehog信号通路抑制剂，作为新型抗肿瘤药物。
[0031] 表1是本发明化合物的Hedgehog信号通路的体外抑制活性结果。
[0032] 表 1
[0033]
Q
[0034] 实施例3 :对髓母细胞瘤的体外抗肿瘤活性测试试验
[0035] 从？1：(：11+/-?53-/-小鼠分离髓母细胞瘤，机械剪碎，0.25%胶原酶（(3〇1138611&86 I)消化后获得的髓母细胞瘤细胞培养于添加B-27supplement (Invitrogen)，EGF 20ng/ml (Invitrogen) , bFGF 20ng/ml (Invitrogen) , nonessential amino acids (Invitrogen), N-acetyl cysteine 60mg/ml,和 Glutamax(Invitrogen)的 Neurobasal A 培养基（Invitrogen);
[0036] 髓母细胞瘤细胞接种于96空培养板，加各种浓度的化合物1作用36h。Brdu实验 采用Merck Millipore的Brdu Cell Proliferation Kit试剂盒，按照试剂盒说明进行；
[0037] 结果表明（如表2所示），本发明的化合物1显示出较好的对ptch+/-p53-/_小 鼠髓母细胞瘤体外抑制活性，其IC 5。值为40. 4nM ;本发明的化合物可以进一步研制开发 Hedgehog信号通路抑制剂，作为新型抗肿瘤药物。
[0038] 表2是本发明化合物对ptch+/-p53-/_小鼠髓母细胞瘤的体外抑制活性结果。
[0039] 表 2
[0040] ?〇
[0041] 实施例4 :体内抗肿瘤活性测试实验
[0042] 取生长良好的Ptch+/-P53-/_小鼠，待髓母细胞瘤长到合适大小，取出，剪切成 1.5_左右，在无菌条件下，接种于5周龄雌性裸鼠（华阜康）的左侧腋窝皮下，待移植瘤体 积长至110mm 3左右，剔除移植瘤过大、过小以及未见生长的裸小鼠，随机分组给药，实验组 灌胃给药（12.5、25、50mg/kg，一天两次，灌胃给药），阴性对照组同时给等量的溶媒0.5% CMC-Na ；
[0043] 肿瘤体积（tumor volume, TV)的计算公式为：TV = 1/2X长X宽X宽，根据测 量的结果计算相对瘤体积（relative tumor volume，RTV)，计算公式为：RTV = Vt/V0其中 V0为分笼给药时测量所得的肿瘤体积，Vt为每一次测量时的肿瘤体积；
[0044] 结果表明（如图1所示），本发明的化合物1显示出较好的对髓母细胞瘤的体内抑 制活性，在 12. 5mg/kg(bid, ig)、25mg/kg(bid, ig)、50mg/kg(bid, ig)三个不同剂量下均显 示很强的体内抗肿瘤活性；本发明的化合物可以进一步研制开发Hedgehog信号通路抑制 剂，作为新型抗肿瘤药物。
【主权项】
1. 化挫献嗦化合物，其特征在于，所述的化合物为含赃嗦的化挫献嗦化合物及其可药 用盐，为具有下述结构的化合物1及其可药用盐，P2. 权利要求1的化挫献嗦化合物在制备化dgehog信号通路抑制剂中的用途。3. 权利要求1的化挫献嗦化合物在制备治疗恶性肿瘤药物中的用途。4. 按权利要求3的用途，其特征在于，所述的恶性肿瘤是化dgehog信号通路异常激活 所致的相关肿瘤，包括髓母细胞瘤、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、结肠癌、膀脫癌、卵巢癌、皮肤 癌。5. 包含治疗有效量的权利要求1所述的化合物及其药用盐的药物组合物。
【文档编号】C07D401/14GK105985321SQ201510072260
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年2月11日
【发明人】赵伟利, 董肖椿, 陆秀宏, 谭文福, 杨君, 鲍小龙, 王娟, 彭元求, 刘原
【申请人】复旦大学