专利名称：一种小麦酯酶生物传感器的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种小麦酯酶生物传感器的制备方法。
背景技术：
在当今世界农业发展过程中，尽管绿色和有机已经成为主题，可是现代农 业很大程度上仍依赖于一些具有负作用的手段，如农药的使用。有机磷类农药 具有品种多、药效高、防治广等优点，在我国农业生产上被大量使用。但是由 于有机磷农药及残留物毒性较大，人长期摄入有机磷农药可表现肝功能下降、 血糖升高、白细胞吞噬功能减退等一系列病理变化，并有致畸、致癌、致突变 的作用，严重者可导致中枢神经系统功能异常，因此有机磷农药残留已成为中 国的主要食品安全性问题。解决农产品的关键问题主要依靠建立一种准确快 速、简单廉价的农药残留检测技术，这已经成为食品安全和环境保护的当务之 急。
生物传感是指一类由生物敏感元件(酶、抗体、受体、细胞及组织器官等)、 信号转换器(电极、光纤、半导体、压电晶体、及表面声波、热敏电阻等)和 检测器结合在一起来进行检测的技术。它利用生物分子的催化作用或特异性来
进行检测，具有仪器体积小、便于携带；响应灵敏、快速；选择性高、 一般不 需要对样品进行预处理等优点，对于用于有机磷农药的生物传感检测技术，最 重要的生物敏感元件——酶的选择。常用于检测有机磷农药检测的酶类为动物 酯酶和植物酯酶。但动物酯酶常常表现为保持期短，需冷冻低温保存，这个缺 点非常不适合现场快速检测。而植物酯酶的优点恰恰是酶源易得，提取和保存 较为方便，且酶源丰富，只需以一定比例的盐溶液或缓冲液混合提取，之后离 心获得的上清液即可作为酯酶粗酶液用于检测。
本发明制备的小麦酯酶生物传感器，具有贮存稳定性高、分离回收容易、 可多次重复使用、操作连续及可控、工艺简便、成本低廉等一系列优点。可应 用于食品中有机磷农药的快速检测。
发明内容
为了解决现有酶生物传感器仪器庞大，设备昂贵，手续复杂，需专业人员进行操作，因此不适于经常性的现场检测等的问题，本发明提供了一种小麦 酯酶生物传感器的制备方法，能有效提高食品中有机磷农药残留测定的速度和 精度，降低生物传感器的成本。本发明中一种小麦酯酶生物传感器的制备方法， 其特征在于小麦酯酶生物传感器的制备方法的步骤如下一、小麦酯酶的提取:
1、小麦经粉碎过40目筛后，准确称量各10.0g，置于100mL锥形瓶中，分别
加入蒸馏水， 一定浓度的盐溶液各30mL，摇床中震荡提取，之后在4000r/min
的速度离心20min，上清液过滤后测酶活，选择出最佳提取溶剂。二、纯化
1、脱盐将硫酸铵分级盐析后，Tris-Hcl (0.07mol/l, pH=8)溶解的酶液装入
透析袋中，对蒸馏水透析48h，并用BaCl2溶液检测透析袋外溶液，直至透析
袋外溶液与BaCl2溶液无沉淀生成。2、使用SephadexG-100凝胶层析柱
(2.5cmx60cm)，洗脱液为缓冲液，以一定的流速每管5ml进行收集，测定每
管酶液比活力，检测时做三个平行样。三、小麦酯酶固定化将去离子水与一
定量的硅酸酯类化合物按照一定比例混合(R值)，加入25kiLHC1， 120mL甘
油溶液(75%)和400mL聚乙烯醇(PVA)溶液(5%),超声30min。之后吸
取80nL溶胶，加入150pL —定浓度的TritonX-lOO和162pL —定浓度的
PEG-400溶液，漩涡振荡20min即得到溶胶。将小麦酯酶以30mL/g的比例溶
解于一定pH值的缓冲溶液中，磁力搅拌一定时间。吸取酶液加入到杂化溶胶
中，旋涡振荡10min。吸取10(HiL的混合溶胶均匀涂布于载玻片上，于4'C干
燥36h，即得到固定化后的小麦酯酶。使用前，将其在pH 6.5的磷酸盐缓冲溶
液中浸泡10min，再用O型圈将该酶膜固定在球型精密型酸度计玻璃电极表
面，即制成小麦酯酶生物传感器。
本发明中，在小麦酯酶固定化方法中，采用壳聚糖吸附-交联法固定化小 麦酯酶，克服了游离小麦酯酶稳定性差、易失活、小麦酯酶催化反应后与反应体系混在一起，无法回收和重复利用、生产成本偏高等缺点。与游离酶相比, 固定化酶在保持其高效、专一及温和的酶催化反应特性的同时，还呈现贮存稳 定性高、分离回收容易、可多次重复使用。所制备的小麦酯酶生物传感器，具 有贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续及可控、工艺简 便、成本低廉等一系列优点。可应用于食品中有机磷农药的快速检测。
具体实施例方式
具体实施方式
一本具体实施方式
中，1、 一种小麦酯酶生物传感器的制 备方法，其特征在于小麦酯酶生物传感器的制备方法的步骤如下 一、小麦酯
酶的提取1、小麦经粉碎过40目筛后，准确称量各10.0g，置于100mL锥形 瓶中，分别加入蒸馏水， 一定浓度的盐溶液各30mL，摇床中震荡提取，之后 在4000r/min的速度离心20min，上清液过滤后测酶活，选择出最佳提取溶剂。 二、纯化1、脱盐将硫酸铵分级盐析后，Tris-Hcl (0.07mol/l， pH=8)溶解 的酶液装入透析袋中，对蒸馏水透析48h，并用BaCl2溶液检测透析袋外溶液， 直至透析袋外溶液与BaCl2溶液无沉淀生成。2、使用SephadexG-lOO凝胶层 析柱(2.5cmx60cm)，洗脱液为缓冲液，以一定的流速每管5ml进行收集，测 定每管酶液比活力，检测时做三个平行样。三、小麦酯酶固定化将去离子水 与一定量的硅酸酯类化合物按照一定比例混合(R值)，加入25^LHC1， 120mL 甘油溶液(75%)和400mL聚乙烯醇(PVA)溶液(5%),超声30min。之后 吸取80pL溶胶，加入150^iL —定浓度的TritonX-lOO和162^iL —定浓度的 PEG-400溶液，漩涡振荡20min即得到溶胶。将小麦酯酶以30mL/g的比例溶 解于一定pH值的缓冲溶液中，磁力搅拌一定时间。吸取酶液加入到杂化溶胶 中，旋涡振荡10min。吸取lOO^iL的混合溶胶均匀涂布于载玻片上，于4""C干 燥36h，即得到固定化后的小麦酯酶。使用前，将其在pH 6.5的磷酸盐缓冲溶液中浸泡10min，再用O型圈将该酶膜固定在球型精密型酸度计玻璃电极表 面，即制成小麦酯酶生物传感器。
具体实施方式
二本具体实施方式
与具体实施方式
一不同的是其特征在
于步骤一中，小麦酯酶的提取，采用0.2mol/LNaCl溶液，摇床中震荡提取温 度为30 50'C。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
三本具体实施方式
与具体实施方式
一不同的是其特征在
于步骤二中使用SephadexG-100凝胶层析柱纯化，洗脱液为0.15mol/L的磷酸 盐缓冲液，流速0.1 0.3mL/min。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
四本具体实施方式
与具体实施方式
一不同的是其特征在 于步骤三中所采用的硅酸盐为TEOS， TritonX-100浓度为5%，固定化酶反应 缓冲液为pH为6.5磷酸盐缓冲液，磁力搅拌20 50min。其它与具体实施方式
一相同。
权利要求
1、一种小麦酯酶生物传感器的制备方法，其特征在于小麦酯酶生物传感器的制备方法的步骤如下一、小麦酯酶的提取1、小麦经粉碎过40目筛后，准确称量各10.00g，置于100mL锥形瓶中，分别加入蒸馏水，一定浓度的盐溶液各30mL，摇床中震荡提取，之后在4000r/min的速度离心20min，上清液过滤后测酶活，选择出最佳提取溶剂。二、纯化1、脱盐将硫酸铵分级盐析后，Tris-Hcl(0.07mol/l，pH＝8)溶解的酶液装入透析袋中，对蒸馏水透析48h，并用BaCl2溶液检测透析袋外溶液，直至透析袋外溶液与BaCl2溶液无沉淀生成。2、使用SephadexG-100凝胶层析柱(2.5cm×60cm)，洗脱液为缓冲液，以一定的流速每管5ml进行收集，测定每管酶液比活力，检测时做三个平行样。三、小麦酯酶固定化将去离子水与一定量的硅酸酯类化合物按照一定比例混合(R值)，加入25μLHCl，120mL甘油溶液(75％)和400mL聚乙烯醇(PVA)溶液(5％)，超声30min。之后吸取80μL溶胶，加入150μL一定浓度的TritonX-100和162μL一定浓度的PEG-400溶液，漩涡振荡20min即得到溶胶。将小麦酯酶以30mL/g的比例溶解于一定pH值的缓冲溶液中，磁力搅拌一定时间。吸取酶液加入到杂化溶胶中，旋涡振荡10min。吸取100μL的混合溶胶均匀涂布于载玻片上，于4℃干燥36h，即得到固定化后的小麦酯酶。使用前，将其在pH 6.5的磷酸盐缓冲溶液中浸泡10min，再用O型圈将该酶膜固定在球型精密型酸度计玻璃电极表面，即制成小麦酯酶生物传感器。
2、 根据权利要求1所述的一种小麦酯酶生物传感器的制备方法，其特征 在于步骤一中，小麦酯酶的提取，采用0.15mol/LNaCl溶液，摇床中震荡提取 温度为30 50。C。
3、 根据权利要求1所述的一种小麦酯酶生物传感器的制备方法，其特征在于步骤二中使用SephadexG-100凝胶层析柱纯化，洗脱液为0.1 0.2mol/L的 磷酸盐缓冲液，流速0.1 0.5mL/min。
4、根据权利要求1所述的一种小麦酯酶生物传感器的制备方法，其特征 在于步骤三中所采用的硅酸盐为TEOS， TritonX-lOO浓度为5%~10%，固定化 酶反应缓冲液为pH为6.0-7.0磷酸盐缓冲液，磁力搅拌20 50min。
全文摘要
一种小麦酯酶生物传感器的制备方法，涉及一种小麦酯酶生物传感器的制备方法。本发明解决了现有酶生物传感器仪器庞大，设备昂贵，手续复杂，需专业人员进行操作，因此不适于经常性的现场检测等问题。一种小麦酯酶生物传感器的制备方法的步骤为首先采用中性盐浸提法提取小麦中小麦酯酶，利用硫酸铵盐析法和柱层析法对提取出的粗酶液进行分离纯化，采用溶胶凝胶法对分离纯化出的小麦酯酶进行固定化，制备出固定化小麦酯酶膜，将其与换能原件相连接，组成检测有机磷农药的生物传感器。本发明制备的小麦酯酶生物传感器，具有不需连接外部电源、不用参考电极、体积小、质量轻、响应速度快、抗电磁干扰、防腐蚀、灵敏度很高、测量带宽很宽、操作简便、成本低廉等优点。可应用于食品中有机磷农药的快速检测。
文档编号G01N27/327GK101576527SQ20091007224
公开日2009年11月11日 申请日期2009年6月11日 优先权日2009年6月11日
发明者岩 焦, 王振宇 申请人:王振宇